免疫介導再生障礙性貧血小鼠模型制備條件的實驗比較研究

張梓倩，李姝儀，袁繼巧，楊 慧，范燕楠，白金葉，馬 培，林明寶，侯 琦

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由物理、生物、化學或其它未明原因所致的一種嚴重血液系統(tǒng)疾病，以骨髓造血功能衰竭致全血細胞減少為特征，臨床主要表現(xiàn)為貧血、出血和感染，嚴重時可危及生命，目前尚無理想治愈方法[1-2]。因此，采用動物模型研究AA的病理病機、篩選更為有效的藥物，對臨床治療至關(guān)重要。常用的AA動物模型包括鈷-60照射聯(lián)合免疫細胞靜脈注射的免疫損傷模型和5-氟尿嘧啶聯(lián)合白消安、苯聯(lián)合環(huán)磷酰胺等化學誘導劑誘導的化學損傷模型[3-6]。其中，免疫損傷模型因更接近于臨床病人的發(fā)病機制而被廣泛應用。

然而，追溯免疫介導AA模型建立的早期中外文獻，使用的均是♀小鼠[5,7]，而后也有許多研究使用了♂小鼠[8-10]，但兩者在造模中的區(qū)別卻鮮有報道，給研究者在動物性別選擇時造成了困惑。此外不同實驗報道的鈷-60照射劑量在1.0～6.0 Gy之間不等[8-12]、檢測時間點在造模第7～28 d不等[8-12]，有限淋巴節(jié)細胞的獲得也加大了實驗難度，且動物實驗存在批間波動性，如何確定適宜的指標檢測時間、保證實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量也是研究者關(guān)注的問題。

針對以上問題，本文在以往研究基礎之上，對免疫介導小鼠AA模型制備過程中的♀♂差異、照射劑量、細胞注射類型、主要檢測指標隨造模時間的動態(tài)變化等造模條件進行了比較研究，以期為AA治療藥物的篩選評價與機制研究提供更為有效、穩(wěn)定可控的模型制備方法。

1 材料

1.1 實驗動物DBA/2小鼠，♂，SPF級，(20±2)g；BALB/c小鼠，♀♂兼用，SPF級，(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京) 2016-0006。

1.2 試劑EDTA-2K(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號20160229)，Thiazole Orange(Sigma-Aldrich，貨號390062，批號MKCB0268V)，RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，貨號SH30809.01，批號AE24464298)，環(huán)孢素軟膠囊(中美華東制藥有限公司)。

1.3 儀器五分類血細胞分析儀(BC-5000vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；流式細胞儀(2060R，ACEA Biosciences)。

2 方法

2.1 不同照射劑量對模型的影響無菌取DBA/2小鼠胸腺、脾臟，分別加1640培養(yǎng)基進行研磨過濾，制備單細胞懸液，脾細胞用紅細胞裂解液裂解紅細胞，配成胸腺-脾細胞2 ∶1的混合淋巴細胞懸液。BALB/c♂小鼠隨機平均分為正常組和模型組。模型組小鼠分別經(jīng)5.6、5.7、5.8、6.0 Gy照射劑量的鈷-60 γ射線全身照射，4 h內(nèi)由尾靜脈輸入DBA/2小鼠混合淋巴細胞懸液每只0.2 mL，細胞量為1×106個。正常組注射等體積溶媒。造模d 15目內(nèi)眥靜脈叢取血50 μL，EDTA-2K抗凝，血細胞分析儀進行外周血全血細胞計數(shù)，Thiazole Orange 染色30 min，流式細胞儀檢測陽性染色細胞比例。

2.2 性別差異、細胞注射類型、指標檢測時間對模型的影響實驗造模方法同“2.1”，淋巴結(jié)細胞取自腋窩、腹股溝、腸系膜等處，制備單細胞懸液。照射劑量為5.8 Gy。實驗動物分為正常組、胸腺-脾細胞2 ∶1混合注射模型組(模型1)、淋巴結(jié)-胸腺細胞2 ∶1混合注射模型組(模型2)，每組♀♂各半，連續(xù)4周目內(nèi)眥靜脈叢取血，檢測外周血全血細胞計數(shù)和網(wǎng)織紅細胞比例，方法同“2.1”，同時記錄并統(tǒng)計生存率。

2.3 環(huán)孢素對模型的驗證造模方法同“2.1”，照射劑量為5.8 Gy。實驗設正常組、模型組和環(huán)孢素給藥組。環(huán)孢素自造模d 1開始灌胃給藥，10 mg·kg-1，連續(xù)給藥14 d。造模d 15，小鼠目內(nèi)眥靜脈叢取血后處死，檢測外周血全血細胞計數(shù)和網(wǎng)織紅細胞比例，取小鼠一側(cè)股骨進行HE染色，檢測組織病理學與有核細胞計數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 不同照射劑量對模型的影響如Tab 1所示，胸腺-脾混合細胞注射的♂小鼠接受5.6～6.0 Gy劑量的鈷-60照射，均可在造模第二周檢測到白細胞、紅細胞和血小板的明顯下降，但5.6、5.7 Gy照射組的小鼠網(wǎng)織紅已恢復至高于正常組，5.8、6.0 Gy照射組網(wǎng)織紅仍明顯低于正常組。各照射劑量組(5.6、5.7、5.8、6.0 Gy)小鼠生存率依次為94.1、83.3、87.5、66.7%。

Tab 1 Effects of different irradiation doses on peripheral blood of AA mice n=6～15)

3.2 性別差異、細胞注射類型、指標檢測時間對模型的影響與正常組相比 (Tab 2)，5.8 Gy鈷-60照射后，各模型組小鼠外周血紅細胞數(shù)、血紅蛋白含量和紅細胞壓積自造模第一周起逐步下降，在第二、三周下降作用明顯，其中模型2組紅細胞值低于模型1組；♀小鼠紅細胞值低于♂小鼠，且在模型2組中差異有統(tǒng)計學意義。除模型2組♀小鼠外，各組紅細胞值于第四周開始恢復。

Tab 2 Effects of different modeling factors on peripheral blood erythrocytes of AA mice n=5～10)

與正常組相比 (Tab 3)，鈷-60照射后，各模型組小鼠外周血白細胞總數(shù)在造模4周內(nèi)下降作用明顯。其中模型2組白細胞值低于模型1組；♀小鼠白細胞值低于♂小鼠，在造模第四周時，模型2組♀小鼠恢復較慢，雌雄差異有統(tǒng)計學意義。在時間動態(tài)上，白細胞總數(shù)及五分類(淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)自造模第一周開始下降，第二周降至最低，第三周開始回升。

Tab 3 Effects of different modeling factors on peripheral blood leukocytes of AA mice n=5～10)

與正常組相比 (Tab 4)，在造模4周內(nèi)，各模型組小鼠外周血血小板數(shù)、血小板壓積均明顯下降。其中模型2組♀小鼠各項指標下降最為嚴重，與♂相比在造模第2～4周內(nèi)差異明顯。在時間動態(tài)上，血小板數(shù)、血小板壓積自造模第一周開始下降，第二周降至最低，第三周開始回升。

Tab 4 Effects of different modeling factors on peripheral blood platelet of AA mice n=5～10)

與正常組相比 (Tab 5)，各模型組小鼠外周血網(wǎng)織紅細胞比例與計數(shù)在造模第一周均明顯下降，模型1組小鼠網(wǎng)織紅比例與計數(shù)在第三周恢復至高于正常組；模型2組♂小鼠網(wǎng)織紅比例在第三周恢復至接近正常組，但細胞計數(shù)仍明顯低于正常組，♀小鼠網(wǎng)織紅比例與計數(shù)在第三周均明顯低于正常組，第四周時細胞計數(shù)仍未恢復至正常水平，表明該組的損傷程度最為嚴重，且模型2組具有雌雄差異。

Tab 5 Effects of different modeling factors on peripheral blood reticulocytes of AA mice n=5～10)

實驗結(jié)果表明，模型1組小鼠生存率較高，♂小鼠為87.5%，♀小鼠為90.9%；模型2組小鼠生存率較低，♂小鼠為60.0%，♀小鼠為50.0%。

3.3 環(huán)孢素對模型的驗證根據(jù)以上結(jié)果，最佳造模條件為5.80 Gy鈷-60 γ射線照射聯(lián)合胸腺-脾細胞2 ∶1靜脈注射，造模第二周進行指標檢測。我們采用AA臨床用藥環(huán)孢素對模型有效性進行了驗證[13]，結(jié)果如Tab 6，7和Fig 1所示，環(huán)孢素對模型小鼠外周血白細胞、血小板、網(wǎng)織紅細胞的降低有明顯恢復作用，并可減輕骨髓造血細胞減少、脂肪細胞增加等病理形態(tài)改變，增加骨髓有核細胞數(shù)量，明顯升高有核細胞/紅細胞比例。結(jié)果表明，該造模條件可造成小鼠全血細胞減少和骨髓造血功能下降，臨床用藥環(huán)孢素對貧血癥狀與骨髓造血均有一定程度改善作用，表明該模型可用于抗AA藥物的篩選與評價。

Tab 6 Effects of cyclosporine on peripheral blood of AA mice n=10～12)

Tab 7 Effects of cyclosporine on bone marrow cells of AA mice n=6)

Fig 1 Effects of cyclosporine on bone marrow morphology of AA mice (HE staining,×200)

4 討論

動物模型造模難點在于動物損傷嚴重程度的控制：損傷過輕，模型恢復過快，模型與正常組的各項考察指標不易產(chǎn)生顯著性差異；損傷過重，動物瀕于死亡，則藥效不能有效呈現(xiàn)。指標測定時間的選擇對實驗的成敗也至關(guān)重要，由于不同指標的改變與恢復時序不同，選擇不同的測定時間點也會影響實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量。因此考察并了解實驗過程中不同條件因素對模型制備的影響、掌握不同檢測指標在疾病進程中的動態(tài)變化規(guī)律，有利于實驗人員在藥效評價與機制研究中對實驗過程進行有效控制，提高實驗效率以及實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量。

因此，本研究針對免疫介導AA模型制備條件的潛在影響因素進行了實驗比較研究。實驗結(jié)果顯示，♀♂小鼠均可在免疫細胞靜脈注射后誘發(fā)全血細胞減少與網(wǎng)織紅細胞下降，但♀小鼠的貧血癥狀比♂小鼠嚴重，且在淋巴結(jié)-胸腺細胞注射模型(模型2)中差異顯著，表明♂小鼠對免疫介導的損傷更為耐受，可能與♂小鼠體內(nèi)雄激素的保護作用有關(guān)[14]。在進行新藥研發(fā)時，由于需同時使用兩種性別的動物對藥物療效進行全面考察，獲取雌雄差異的數(shù)據(jù)，因此在進行實驗時應注意雌雄動物模型在損傷程度上的差異性對藥效的影響。

免疫細胞注射類型的對比實驗結(jié)果顯示，兩種細胞混合方式均可導致全血細胞減少與網(wǎng)織紅細胞水平下降，進一步實驗表明，胸腺-脾臟混合細胞模型小鼠的血象、骨髓象均可發(fā)生明顯改變，與臨床AA的主要癥狀一致，臨床用藥環(huán)孢素在一定程度上可改善以上病理狀態(tài)，表明該模型也可用于抗AA藥物的篩選與評價。兩種模型的區(qū)別在于，在造模嚴重程度方面，淋巴結(jié)-胸腺混合細胞對小鼠的損傷程度強于胸腺-脾臟混合細胞，在♀小鼠的降紅方面更具優(yōu)勢；在實驗操作方面，由于淋巴節(jié)細胞數(shù)量小、摘取過程繁瑣，采用胸腺-脾臟混合細胞進行替代更為便捷、易操作，有利于多組別大樣本量藥效學實驗的高效進行；在♀♂差異方面，淋巴結(jié)-胸腺混合細胞模型的♀♂差異較大，胸腺-脾臟混合細胞模型的差異不明顯，對于在藥效上具有♀♂差異的藥物，應用胸腺-脾臟混合細胞模型則藥效雌雄差異更易體現(xiàn)。

不同檢測指標隨造模時間的動態(tài)變化趨勢存在差異。網(wǎng)織紅細胞是分化未成熟的紅細胞，可反映骨髓紅系造血功能[15]，網(wǎng)織紅細胞比例與計數(shù)在造模后快速下降，并快速恢復，是本次實驗中最為敏感的指標，由于模型較輕時恢復較快，應注意把握測定時間。血小板與白細胞總數(shù)在造模后迅速下降，但恢復期晚于網(wǎng)織紅，且恢復速度緩慢，直至第四周仍顯著低于正常組。紅細胞在造模后下降程度最小且下降速度最緩慢，也是最晚恢復的指標，但早于血小板和白細胞恢復至正常水平。

綜上所述，性別、免疫細胞類別、照射劑量均是影響造模程度的重要因素，本研究結(jié)果提示：免疫介導AA的最佳造模條件為♂小鼠5.80 Gy鈷-60 γ射線照射聯(lián)合胸腺-脾細胞2：1靜脈注射，造模后第二周進行指標檢測。但是，不同實驗室可根據(jù)本實驗室的具體情況與實驗目的選擇適當?shù)哪Ｐ蜅l件，通過選擇雌雄、免疫細胞類別與注射量、照射劑量等因素有效調(diào)節(jié)模型的損傷程度。綜合各指標的變換趨勢，造模后二至三周應為指標測定的較適宜時間。藥效呈現(xiàn)的最佳時間是在模型發(fā)展期、最嚴重期、還是恢復期，可能尚需結(jié)合不同藥物的自身特性進行具體研究，從而有效控制藥效實驗過程，為高效、低毒、經(jīng)濟的AA治療藥物的研發(fā)提供保證。