淫羊藿總黃酮調控miR-34a-5p保護成骨細胞脂多糖誘導性損傷的作用機制

張 麗，張 揚，王緒平，黃孝聞，壽 旦

(1.浙江中醫藥大學藥學院，2.浙江省中醫藥研究院中藥研究中心，浙江 杭州 310000)

慢性骨髓炎(chronic osteomyelitis，CO)是一種涉及骨組織、骨髓、骨皮質及周圍軟組織的慢性炎癥過程[1]。其發病機制復雜，在炎癥刺激下成骨細胞與破骨細胞之間的平衡被打破[2]，破骨細胞將死骨邊緣吸收，成骨細胞不斷分化包繞在死骨周邊，最終導致局部血運差，骨愈合能力低下，造成骨量丟失[3]。而骨修復是CO治療的主要難點之一。因此，探索副作用少、有效促進骨修復的藥物對CO治療具有積極意義。

中醫學認為淫羊藿具有補腎壯陽，益精健骨的功效[4]。其對骨科疾病的治療已有廣泛的應用和確切的療效證明。淫羊藿總黃酮(total flavones ofepimedium，TFE)是由淫羊藿藥材提取所得的黃酮單體類成分的總稱，體內外實驗結果證明，TFE是淫羊藿治療骨傷類疾病的有效部位[5]。TFE可有效減緩骨質疏松大鼠骨丟失，增加骨密度，改善骨代謝[6]。課題組前期發現TFE對CO具有治療作用[7]。然而其對CO骨修復的作用機制尚不明確。有研究報道，miRNA是骨損傷疾病最重要和最活躍的調控因子之一，一些miRNAs可以通過調控破骨細胞及成骨細胞功能參與骨損傷疾病的病理過程[8]。經前期試驗研究在對兔慢性骨髓炎模型轉錄組測序后發現：模型組骨組織中miR-34a-5p水平較正常組顯著下降。然而TFE調控miR-34a-5p治療CO的機制尚未闡明。

本實驗建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的成骨細胞模型，運用生物信息學技術和雙熒光素酶報告基因確定miR-34a-5p的靶基因。采用ELISA法檢測細胞炎性因子，RT-PCR檢測miR-34a-5p、SMAD2、Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcriptionfactor 2，RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)mRNA表達，Western blot檢測SMAD2、RUNX2、ALP蛋白表達。闡明TFE影響miR-34a-5p進而調控成骨相關因子促進骨修復的作用機制，為補腎中藥治療CO的機制提供新思路和新靶點。

1 材料

1.1 實驗動物40只SPF級8周齡SD大鼠，♂，體質量(200±20) g，購于浙江省動物實驗中心，動物實驗許可證號：SYXK(浙)20190010。

1.2 藥物與試劑中藥淫羊藿購自浙江中醫藥大學飲片廠，經浙江省中醫藥研究院俞忠明副主任中藥師鑒定，為小檗科淫羊藿屬植物朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 培養基(美國Gibco公司)；MTT、ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、茜素紅染色試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；TRIzol提取試劑盒(美國Ambion公司)；反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒(杭州博日科技有限公司)；Real-time PCR引物(上海生工生物公司)；miR-34a-5p mimics、miR-34a-5p inhibitor、miRNA Negative Control及雙熒光素酶構建載體、LipofectamineTM2000轉染試劑盒、雙熒光素酶報告系統(中國上海吉瑪制藥技術有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；RUNX2抗體(bs-1134R)、SMAD2抗體(bs-0718R)、ALP抗體(bs-52252R)(北京博奧森生物技術有限公司)；GAPDH抗體(ab181602)及辣根酶標記山羊抗兔IgG(ab6721)(英國Abcam公司)。

1.3 主要儀器CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；ECLIPSE TS100-F倒置顯微鏡 (日本Nikon公司)；MRZ14M010高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；SpectraMax190多功能酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司)；ChemiDocXRS凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)。

2 方法

2.1 TFE及含藥血清制備朝鮮淫羊藿藥材，粉碎過40 目篩，精密稱取藥材粉末50 g，置于圓底燒瓶中，加8倍量70%乙醇，90 ℃水浴加熱回流2次，每次2 h，趁熱過濾，合并濾液。減壓濃縮至生藥濃度0.25 mg·L-1，經紫外可見分光光度計測得總黃酮含量為6.563%，提取液冰箱放置備用。取SD大鼠，參照文獻方法制備含藥血清[9]。將大鼠隨機分為給藥組和對照組。給藥組每天給予2 mL TFE提取物150 mg·kg·d-1，連續灌胃1周。對照組灌胃給予等體積蒸餾水。末次給藥后1 h，無菌條件下腹主動脈取血，4 000r·min-1離心15 min分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃保存備用。

2.2 原代成骨細胞的制備及分組以新生大鼠顱蓋骨制備原代大鼠成骨細胞，培養于含10%胎牛血清，100 kU·L-1雙抗的DMEM高糖培養基中。以10 mg·L-1LPS干預成骨細胞為模型組；DMEM高糖培養基培養為正常對照組；TFE含藥血清組在給予LPS的同時給予TFE含藥血清(5%、10%、15%,20%)。

2.3 MTT法測定細胞活性取第3代生長良好的大鼠成骨細胞，以2×107個·L-1接種于96孔培養板，培養24 h后，按實驗分組分別加入不同的培養基100 μL。繼續培養48 h后，每孔加入20 μL MTT試液，4 h后棄去MTT及培養基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。在490 nm測定吸光度(A)，按照公式計算細胞存活率：細胞存活率/%= (A實驗組/A對照組)×100%。

2.4 成骨細胞堿性磷酸酶合成及鈣沉積的測定取對數生長期的成骨細胞，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養24 h后，更換無血清的DMEM培養基培養12 h。將細胞隨機分3組：正常對照組、模型組(LPS 10 mg·L-1)、TFE含藥血清組(10%)，隔天換液。繼續培養48 h后，按照堿性磷酸酶試劑盒操作說明進行染色，培養14 d后進行茜素紅染色。

2.5 ELISA法檢測炎性因子表達的影響各組細胞培養48 h后，收集、離心取上清，按照試劑盒說明書，用ELISA檢測試劑盒測定白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、骨鈣素(osteocalcin，OC)的表達。

2.6 熒光素酶報告質粒的構建和熒光素酶活性分析運用TargetScan、PicTar、MiRBase、BibiServ、Tarbase等多個生物信息學軟件，對miR-34a-5p潛在的靶基因進行預測分析，確定SMAD2為miR-34a-5p的潛在靶基因。構建野生型和突變型基因靶點SAMD2的3′UTR熒光素酶表達載體(WT-SAMD2和MUT-SMAD2)，GP-miRGLO空白載體質粒作為對照。實驗分為4組：共轉染野生型SMAD2+miR-34a-5p mimics組、共轉染野生型SMAD2+ NC組、突變型SMAD2+miR-34a-5p mimics組、突變型SMAD2+NC組。使用LipofectamineTM2000共轉染進HEK293T細胞，轉染24 h后收集細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測量熒光素酶活性。

2.7 細胞轉染將成骨細胞接種于6孔板中，接種密度為40%～60%，在不含雙抗的10%FBS DMEM培養基中培養24 h后，使用LipofectamineTM2000轉染試劑向成骨細胞轉染miR-34a-5p mimics與miR-34a-5p inhibitor。轉染6 h后，分別更換相應培養基繼續培養48 h后，收集細胞進行后續實驗。細胞分組如下：正常對照組，LPS模型組(培養液加入LPS 10 mg·L-1)、mimics NC組(mimics NC+LPS)、miR-34a-5p組(miR-34a-5p mimics+LPS)、TFE含藥血清組(LPS+TFE)、inhibitor NC組(inhibitor NC+LPS+TFE)、miR-34a-5p inhibitor組(miR-34a-5p inhibitor+LPS+ TFE)。

2.8 RT-PCR檢測成骨細胞各組轉染前后RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA表達水平按TRIzol說明書提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。熒光定量PCR反應體系為：SYBRPremix10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA產物稀釋10倍后加入2 μL，ddH2O 6 μL。反應在7500熒光定量PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，共40個循環。引物如下：miR-34a-5p上游引物5′-TGCGCTGGC AGTGTCTTAGCTG-3′，下游引物5′-CCAGTGCAG GGTCCGAGGTA-3′；SMAD2上游引物5′-CTCTCCG GCTGAACTGTCTC-3′，下游引物5′-GCCGTCTACAG TGAGTGAGG-3′；RUNX2上游引物5′-CATGGCCG GGAATGATGAG-3′，下游引物5′-TGTGAAGACCGT TATGGTCAAAGTG-3′；ALP上游引物5′-CATCGCC TATCAGCTAATGCACA-3′，下游引物5′-ATGAGGT CCAGGCCATCCAG-3′；U6上游引物5′-CGCTTCAC GAATTTGCGTGTCAT-3′，下游引物5′-CAAAGTGCT TACAGTGCAGGTAG-3′；β-actin上游引物5′-GGA GATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物5′-GACT CATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

2.9 Western blot檢測成骨細胞各組轉染前后SMAD2、ALP、RUNX2蛋白的表達收集培養48 h的各組細胞，裂解并提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并在99 ℃下變性5 min。每組取蛋白質樣本20 μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。室溫下，5% BSA封閉0.5 h，封閉后與1 ∶1 000稀釋的一抗(SMAD2、ALP、RUNX2、GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜。次日加入對應的二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，用化學發光底物試劑檢測，BioRad系統曝光。用Image Lab軟件對蛋白灰度值進行分析。

3 結果

3.1 MTT檢測成骨細胞增殖率的比較MTT法檢測結果顯示(Fig 1)，與正常成骨細胞組比較，模型組(LPS 10 mg·L-1)誘導的成骨細胞存活率下降至53.55% (P<0.01)，降低程度適中，重復性好。與模型組相比，TFE含藥血清作用濃度為10%時，細胞活力最高，為77.38%。

Fig 1 Effect of TFE-containing serum on survival rate of **P<0.01 vs control groups;##P<0.01 vs model groups

3.2 ELISA檢測大鼠成骨細胞中IL-6、TNF-a、OC、堿性磷酸酶含量、鈣結節表達水平ELISA結果表明，LPS誘導的成骨細胞IL-6和TNF-α炎性因子表達水平增加(P<0.01)(Fig 2A)。與正常組相比，模型組骨鈣素分泌減少，10% TFE含藥血清作用細胞48 h后，骨鈣素質量濃度高于LPS組(P<0.05)。堿性磷酸酶染色結果顯示，模型組堿性磷酸酶表達減弱，TFE作用后促進堿性磷酸酶的表達(Fig 2B)。茜素紅染色結果顯示，LPS抑制大鼠成骨細胞鈣結節形成，TFE含藥血清組鈣結節較模型組增加(Fig 2C)。

Fig 2 Expression of IL-6,TNF-α,OC,alkaline phosphatase,and calcium nodules in n=3)A:IL-6,TNF-a and OC activity were detected by ELISA;B:ALP staining was performed on day 2;C:Alizarin red staining was performed to indicate mineral deposition on day 14.*P<0.05,**P<0.01 vs control groups;#P<0.05,##P<0.01 vs model groups

3.3 TFE對LPS誘導的大鼠成骨細胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達的影響與正常對照組相比，模型組miR-34a-5p mRNA，RUNX2、ALP mRNA及蛋白表達降低，SMAD2 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比，TFE含藥血清組miR-34a-5p mRNA，RUNX2、ALP mRNA及蛋白表達升高，SMAD2 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)(Fig 3A,B)。以上結果表明，TFE能上調LPS誘導的成骨細胞miR-34a-5p水平，下調SMAD2蛋白表達，并促進相關成骨因子ALP、RUNX2的表達。

3.4 miR-34a-5p對SMAD2表達的靶向調控作用生物信息學軟件Targetscan等預測miRNA靶序列，確定miR-34a-5p的潛在靶基因為SMAD2(Fig 4A)。雙熒光素酶報告系統結果顯示，與陰性對照組比較，miR-34a-5p模擬物組可抑制與SMAD2 3’UTR融合的熒光素酶報告基因(P<0.01)(Fig 4B)。Western blot結果發現，與mimics NC組比較，miR-34a-5p mimics組的SMAD2蛋白表達量降低(P<0.05)；與inhibitor NC組比較，miR-34a-5p inhibitor組的SMAD2蛋白表達量升高(P<0.05)(Fig 4C)，提示miR-34a-5p可以直接靶向調節SMAD2的表達。

Fig 3 Effect of TFE-containing serum on RUNX2,ALP,miR-34a-5p,SMAD2 mRNA and protein expression in LPS-induced n=3)A:RT-PCR was performed to analyze the expressions of RUNX2,ALP,miR-34a-5p,SMAD2 mRNA.B:Western blot research showed the protein levels of RUNX2,ALP,SMAD2,*P<0.05,**P<0.01 vs control groups;#P<0.05,##P<0.01 vs model groups.

Fig 4 SMAD2 expression inhibited by miR-34a-5p via binding to its 3’ n=3)A:Diagram of putative miR-34a-5p binding sequence in SMAD2 3′UTR and its mutant in luciferase reporter assay.B:Luciferase reporter assay was performed to measure luciferase activity in osteoblasts.C:Western blot analysis of SMAD2 protein level in osteoblasts.*P<0.05,**P<0.01 vs mimics NC groups;#P<0.05,##P<0.01 vs inhibitor NC groups.

3.5 過表達miR-34a-5p對LPS誘導成骨細胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達的影響與正常對照組比較，模型組miR-34a-5p mRNA，RUNX2、ALPmRNA及蛋白表達降低，SMAD2mRNA及蛋白表達增加(P<0.05)。與模型組比較，miR-34a-5p組miR-34a-5p mRNA，RUNX2、ALPmRNA及蛋白表達明顯增加，SMAD2mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)(Fig 5A,B)。

Fig 5 Effect of overexpression of miR-34a-5p on RUNX2,ALP,SAMD2,miR-34a-5p mRNA expression in LPS-induced osteoblasts n=3)A,B:qRT-PCR and Western blot were performed to analyze the mRNA and protein levels of osteogenic-specific markers after transfection of miR-34a-5p mimics.*P<0.05,**P<0.01 vs control groups;#P<0.05,##P<0.01 vs model groups.

3.6 抑制miR-34a-5p對LPS誘導成骨細胞中RUNX2、ALP、miR-34a-5p、SMAD2 mRNA及蛋白表達的影響結果如Fig 6A和B所示，與模型組相比，TFE組miR-34a-5p mRNA，RUNX2、ALP mRNA及蛋白表達升高，SMAD2mRNA表達降低(P<0.05)，但抑制miR-34a-5p能消除上述作用。

Fig 6 Effect of TFE-containing serum on RUNX2,ALP,SAMD2,miR-34a-5p mRNA expression in LPS-induced osteoblasts after inhibition of A,B:RT-PCR and Western blot were performed to analyze the mRNA and protein levels of osteogenic-specific markers after miR-34a-5p inhibitor transfection.*P<0.05,**P<0.01 vs model groups;#P<0.05,##P<0.01 vs TFE-containing serum groups.

4 討論

CO具有發病率高、肢殘率髙、反復發作、治療難度大等特點，嚴重影響患者的生活質量及生命安全。目前，根除骨感染和病灶清除后骨缺損的修復仍然是治療CO的主要挑戰[10]。研究表明TFE可通過多靶點多途徑有效發揮骨保護作用。TFE不僅能夠刺激成骨細胞的增殖，還能提高其礦化成熟能力[11-12]，淫羊藿苷[13]可促進骨髓間充質干細胞成軟骨分化并抑制破骨細胞活性。本研究發現，TFE可調控LPS誘導的大鼠成骨細胞ALP表達，提高OC活性，減輕成骨細胞損傷。

研究發現[14]，miR-34a是一種內源性破骨細胞抑制劑，可通過抑制Tgif2來間接抑制OPG/RANK/RANKL通路，達到抑制破骨細胞增殖、分化的作用。此外，miR-34a可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥應答，抑制破骨細胞的形成，從而改善骨質疏松，并且可以促進骨髓間充質干細胞及脂肪干細胞成骨分化[15]。本研究結果表明，TFE可上調LPS誘導的成骨細胞miR-34a-5p表達。生物信息學提示，SMAD2是miR-34a-5p的靶基因。SMAD2是轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族主要成員之一，屬于受體調節型Smads (R-Smads)，SMAD蛋白作為關鍵的細胞內信使，可將細胞外信號轉導至細胞核，進而激活下游基因轉錄。SMAD2被TGF-β受體激活并誘導TGF-β反應，充當成骨和骨再生的調節劑。研究發現，SMAD2的下調可以上調ALP、RUNX2等成骨基因的表達，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[16]。本實驗研究發現，在LPS誘導的大鼠成骨細胞中，TFE含藥血清作用后抑制了SMAD2mRNA和蛋白表達，并促進ALP和RUNX2蛋白表達，進而增加成骨細胞成骨能力，減輕成骨細胞損傷。miR-34a-5p inhibitor轉染細胞后ALP、RUNX2 mRNA與蛋白降低，SMAD2 mRNA與蛋白表達量升高，表明抑制miR-34a-5p表達逆轉了TFE對LPS誘導的大鼠成骨細胞損傷的保護作用。

綜上所述，TFE通過促進miR-34a-5p表達，靶向抑制SMAD2蛋白表達，促進成骨細胞ALP和RUNX2蛋白表達，進而促進成骨細胞活性，減輕LPS誘導大鼠成骨細胞損傷的作用機制。