雞豆黃素A抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其機(jī)制的研究

韓俊輝，楊 麗，俞益桂，薛海霞，吳文寧，李維祖，尹艷艷

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,合肥 安徽 230032)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以中老年人為主體的神經(jīng)退行性疾病，其病理學(xué)特征為黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的凋亡和喪失[1]。迄今為止該疾病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，在臨床上沒有可靠有效的治療方法。研究表明：腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)可以通過血管緊張素1受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)在神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和多巴胺能變性的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。不同的致病因素如衰老、神經(jīng)毒素、促炎因子都可以導(dǎo)致RAS的激活，局部或旁分泌的RAS是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶的激活劑，并且參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。這提示血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與PD的病程有密切的關(guān)系。

雞豆黃素A(biochaninA，Bioch A)是異黃酮類植物雌激素，具有抗高血壓[3]、抗細(xì)胞凋亡[4]，對AD小鼠模型具有保護(hù)作用[5]。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bioch A能抑制LPS誘導(dǎo)的BV2活化，主要是通過抑制氧化應(yīng)激，減少炎癥因子的釋放。但是，關(guān)于雞豆黃素A抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制尚未完全明確，本研究通過建立AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的體外模型，觀察Bioch A抑制AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)株(來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞中心細(xì)胞室)。

1.2 藥品與試劑DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)：杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、雞豆黃素A(Bioch A)、過硫酸銨(AP)：美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(Trypsin)、NO檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)、RIPA裂解液(弱)、青霉素-鏈霉素溶液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜：美國Millipore公司；甲醇：上海化學(xué)試劑公司；超敏感底物發(fā)光試劑盒：北京全品速生物科技有限公司；鼠抗β-actin抗體(AF5001)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗P47phox抗體(BS1846)、兔抗gp91phox抗體(BS9035)：美國Bioworld公司；兔抗ASC抗體(67824S)、兔抗Caspase-1抗體(NB100-56565)、兔抗IL-1β抗體(12426S)、兔抗TNF-α抗體(11948S)、兔抗IL-6抗體(12912S)：英國Abcam公司；兔抗NLRP3抗體(15101S)：美國CST公司。

1.3 主要儀器GR600A立式全自動蒸汽滅菌器：致微(廈門)儀器有限公司；CHL2FM3型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；SpectraMax190型全波長酶標(biāo)儀：美國Molecular Device公司；DHG-9070型恒溫烘箱：三發(fā)(上海)科學(xué)儀器有限公司；4600 Mini型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：毆翔科學(xué)儀器有限公司；IC 1000型Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：睿鈺(上海)生物科技有限公司；TGL-20M型全自動高速低溫離心機(jī)：黑馬(珠海)醫(yī)學(xué)儀器有限公司；HealForce100型恒溫培養(yǎng)箱：力康(香港)生物醫(yī)療科技有限公司；WH2型漩渦混合儀：瀘西(上海)分析儀器廠。

2 方法

2.1 BV2細(xì)胞株的培養(yǎng)將BV2細(xì)胞接種于含10%血清(FBS)和1%青霉素和鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，然后將該培養(yǎng)瓶放置在5% CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d更換一次。待顯微鏡下觀察到細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)瓶面積90%以上或細(xì)胞鋪滿瓶底時，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。使用Countstar自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞數(shù)目。待在顯微鏡下觀察到細(xì)胞長滿80%～90%時，提前配制凍存液對處在對數(shù)生長期的增殖能力強(qiáng)的BV2細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞復(fù)蘇過程要盡量加快速度，以免凍存液中的DMSO在常溫下殺傷細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 AngⅡ劑量的篩選為了選擇合適的AngⅡ造模濃度。試驗(yàn)將BV2細(xì)胞分成6組，分別為AngⅡ(0、25、50、100、200、400 nmol·L-1)組，除對照組外，其余每組加入相應(yīng)濃度的AngⅡ，恒溫箱中孵育24 h，再加入新鮮配制的MTT(0.5 g·L-1)37 ℃孵育4 h，4 h后用移液器吸去培養(yǎng)板中的上清液，將100 μL的DMSO加入每個孔中，振搖10 min，保證室溫避光，使甲瓚充分溶解于DMSO中，用全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，波長為490 nm，應(yīng)重復(fù)至少3次以上的實(shí)驗(yàn)。

2.3 NO的測定使用Griess法檢測紅色重氮化合物從而間接測定NO，試驗(yàn)將BV2細(xì)胞分成6組，分別為AngⅡ(0、25、50、100、200、400 nmol·L-1)組；除Control組外，其余各組均加入AngⅡ(100 nmol·L-1)恒溫箱中培養(yǎng)24 h。最后收集每組細(xì)胞上清。用Griess試劑盒測定吸光度，并計(jì)算出各組NO含量。

2.4 ROS檢測使用DCFH-DA探針法檢測Bioch A對BV2激活后的ROS的表達(dá)水平。試驗(yàn)將BV2細(xì)胞分為7組，分別為Control組，AngⅡ(100 nmol·L-1)，Losartan(1 μmol·L-1)組，AngⅡ(100 nmol·L-1)+Losartan(1 μmol·L-1)組，AngⅡ+Bioch A(1.25 μmol·L-1)組，AngⅡ+Bioch A(2.5 μmol·L-1)組，AngⅡ+Bioch A(5 μmol·L-1)組，分別加上以上藥物預(yù)處理2 h,除Control組和Losartan(1 μmol·L-1)外，其余各組均加入AngⅡ(100 nmol·L-1)孵育24 h。并在正置熒光顯微鏡下用DCFH-DA探針法采集相應(yīng)圖像，利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，檢測各組平均熒光強(qiáng)度。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)收集細(xì)胞上清液：離心，去除顆粒和聚合物，按一次用量分裝，凍存于-80 ℃冰箱中，避免反復(fù)凍融，確保樣品在室溫下解凍均勻。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度設(shè)兩個空；加樣：在酶標(biāo)儀包被板上待測樣本孔先加待測樣本，再加樣本稀釋液；溫箱溫育：依次標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記過的檢測抗體并蓋上封板膜，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，棄去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次，拍干。避光孵育顯色：每孔分別加入底物A、B各50 μL，振搖混勻，37 ℃避光孵育15 min。終止測定：每孔加入終止液50 μL，空白孔調(diào)零，在450 nm波長處測定各孔的OD值。用ELISA試劑盒，分別測量TNF-α、IL-1β炎癥因子的含量。

2.6 蛋白免疫印記法(Western blot)在培養(yǎng)好的細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取蛋白。BCA試劑盒定量后各組取適量樣品按樣品和蛋白上樣緩沖液4 ∶1比例進(jìn)行變性。將變性后蛋白加入進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，后用含5%的脫脂奶粉的TBST溶液進(jìn)行室溫封閉1 h，封閉好的膜用TBST洗3次，后將膜至于相應(yīng)的一抗中4 ℃過夜。次日，TBST洗3次后，室溫孵二抗1 h，結(jié)束后用TBST洗3次，再用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)，放入化學(xué)成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。蛋白條帶用ImageJ軟件檢測光密度。

3 結(jié)果

3.1 AngⅡ劑量的篩選為了選擇合適的AngⅡ造模濃度，我們采用MTT法檢測細(xì)胞活力。Fig 1結(jié)果顯示，當(dāng)AngⅡ的濃度低于100 nmol·L-1時，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的MTT值有逐漸升高的趨勢；當(dāng)AngⅡ的濃度大于100 nmol·L-1時，對MTT值進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組低于Control，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此時AngⅡ?qū)V2細(xì)胞作用轉(zhuǎn)變?yōu)閾p傷作用而不是激活作用，因此我們選取AngⅡ(100 nmol·L-1)誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活化。

Fig 1 Effects of different concentrations of AngⅡ on BV2 cells *P<0.05 vs control group.

3.2 不同濃度的AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響采用Griess法檢測各組細(xì)胞上清液中NO的含量，結(jié)果如Fig 2所示，與對照組相比較，當(dāng)AngⅡ濃度為100 nmol·L-1時，細(xì)胞上清液的NO含量增加最多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；當(dāng)AngⅡ濃度大于100 nmol·L-1時，細(xì)胞上清液的NO含量出現(xiàn)下降，這時的AngⅡ?qū)V2細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的損傷，引起細(xì)胞凋亡。

Fig 2 Effects of different concentrations of AngⅡ on NO production in BV2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group.

3.3 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生ROS的影響采用DCFH-DA探針法，檢測AngⅡ誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度，并分析統(tǒng)計(jì)各組平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果如Fig 3所示，與對照組相比較，AngⅡ組ROS熒光強(qiáng)度升高(P<0.01)；與AngⅡ組相比，Bioch A (5.0 μmol·L-1)組和losartan組ROS表達(dá)量降低(P<0.01)，Bioch A (1.25、2.5 μmol·L-1)組ROS的表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)意義；Losartan組ROS表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)；結(jié)果表明，加入Losartan阻斷AT1R后可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平，Bioch A能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高。

Fig 3 Effects of Bioch A on ROS production in

3.4 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞上清中TNF-α，IL-1β釋放量的影響采用ELISA法檢測AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β的含量。結(jié)果如Fig 4所示，與Control組比較，AngⅡ組上清液中TNF-α、IL-1β含量上調(diào)(P<0.01)；與AngⅡ組比，Losartan組TNF-α、IL-1β含量下調(diào)(P<0.01)，Bioch A組(2.5 μmol·L-1)TNF-α、IL-1β含量下調(diào)(P<0.05)，而Losartan組TNF-α、IL-1β含量未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05)；上述結(jié)果表明，Bioch A可以抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β含量的表達(dá)。

Fig 4 Effects of Bioch A on release of IL-1β and TNF-α **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.

3.5 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞AT1R的影響結(jié)果如Fig 5所示，與對照組相比，AngⅡ組細(xì)胞的AT1R蛋白表達(dá)量增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與AngⅡ組相比較，Bioch A (1.25、2.5、5.0 μmol·L-1)組的AT1R蛋白的表達(dá)量未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)。

Fig 5 Effects of Bioch A on the expression of AT1R in AngⅡ-induced BV2 cells1.Control group;2.AngⅡ(100 nmol·L-1)group;3.AngⅡ+Bioch A(1.25 μmol·L-1)group;4.AngⅡ+Bioch A(2.5μmol·L-1);5.AngⅡ+Bioch A(5 **P<0.01 vs control group.

3.6 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞gp91phox、P47phox蛋白的影響結(jié)果如Fig 6所示，與Control組比較，AngⅡ組蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)；與AngⅡ組比較，Losartan組蛋白水平下調(diào)(P<0.01)，Bioch A(2.5 μmol·L-1組蛋白水平下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果表明，Bioch A能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞gp91phox、P47phox蛋白表達(dá)。

Fig 6 Effect of Bioch A on gp91phox,P47phox induced by AngⅡ in A:gp91phox protein expression B:P47phox protein expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.

3.7 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 7所示，與Control組比較，AngⅡ組蛋白表達(dá)水平含量上調(diào)(P<0.01)；與AngⅡ組比，Losartan組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平下調(diào)(P<0.01)，Bioch A組蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，而Losartan組TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)未出現(xiàn)明顯差異。結(jié)果表明，Bioch A可以抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達(dá)。

Fig 7 Effect of Bioch A on IL-1β,IL-6,TNF-α protein expression in microglial cells induced by A:IL-1β protein expression;B:IL-6 protein expression;C:TNF-α protein expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs AngⅡ group.1:Control;2:AngⅡ;3:Losartan;4:AngⅡ Losartan;5:AngⅡ Bioch A

3.8 Bioch A對AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 8所示，與Control組比較，AngⅡ組蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)；與AngⅡ組比，Losartan組ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白水平下調(diào)(P<0.01)，Bioch A組ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白水平下調(diào)(P<0.05)；結(jié)果表明，Bioch A可以抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中，ASC、Caspase-1及NLRP3蛋白的表達(dá)。

Fig 8 Effects of Bioch A on the levels of ASC,Caspase-1 and NLRP3 in AngⅡ-induced BV2 A:ASC protein expression;B:Caspase-1 protein expression;C:NLRP3 protein expression.**P<0.01 vs control group;##P<0.05,#P<0.01 vs AngⅡ group.1:Control;2:AngⅡ;3:Losartan;4:AngⅡ Losartan;5:AngⅡ Bioch A

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的黑質(zhì)致密部血管緊張素Ⅱ水平高，提示DA能神經(jīng)元的凋亡可能與AngⅡ水平高有關(guān)。RAS主要存在于循環(huán)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)血容量和水鹽平衡。本實(shí)驗(yàn)中采用AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的體外模型，觀察Bioch A抑制AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化的機(jī)制。不同濃度AngⅡ處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，AngⅡ(100 nmol·L-1)誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活力最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用AngⅡ(100 nmol·L-1)用于后續(xù)造模。

神經(jīng)炎癥在PD的病理進(jìn)程中起著重要的作用[6]，它參與線粒體損傷、氧化應(yīng)激等過程，甚至是PD相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞在受到免疫炎性因素等刺激或者微環(huán)境因子發(fā)生變化時，迅速地被激活，同時活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量包括NO、ROS、TNF-α和IL-1β等促炎因子或毒性物質(zhì)，如果這些促炎因子或毒性物質(zhì)不停地釋放，將會導(dǎo)致神經(jīng)元變性甚至死亡。

AngⅡ作為RAS最重要的效應(yīng)物，與AT1R相互作用，激活NADPH氧化酶復(fù)合物，進(jìn)而介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在PD動物模型中，我們觀察到AngⅡ通過AT1R提高了黑質(zhì)NADPH氧化酶的活性[7-8]。此外，其他研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞激活和NADPH衍生自由基在多巴胺能神經(jīng)損傷中起主要作用，可能在PD中起重要作用[9-10]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能在AngⅡ誘導(dǎo)的PD模型中增強(qiáng)多巴胺能細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用[11-12]。

NLRP3炎癥小體的激活主要通過3種模式，其中一種模式和NADPH氧化酶相關(guān)的ROS的生成增加有關(guān)。有相關(guān)研究表示，線粒體中的ROS是調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵信號[13-15]。在本實(shí)驗(yàn)中，AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生ROS，進(jìn)而增加NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)。NLRP3炎癥體的激活可以調(diào)控炎癥因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)的增加。說明AngⅡ可能跟通過NLRP3炎癥小體促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，促進(jìn)炎癥因子的釋放，參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)給予Bioch A后，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化被抑制，NLRP3炎癥體的活化被抑制，炎癥因子的釋放也被抑制。

綜上所述：Bioch A可以有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，且Bioch A可能通過NLRP3炎癥小體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，也為以后植物雌激素治療PD提供新的研究方向。