鹽酸二甲雙胍抑制破骨細胞分化的研究

周琳 楊明理 曾春平* 龍濤 樊秀云

1.廣州醫科大學附屬第五醫院內分泌科，廣州醫科大學第五臨床學院，廣東 廣州 5107002.遵義醫科大學醫學遺傳學教研室，貴州 遵義 563000

骨重建包括骨形成和骨吸收兩種相互平衡的過程，分別由成骨細胞和破骨細胞調控[1]。破骨細胞的過度作用導致骨吸收增多，打破骨形成和骨吸收的平衡，將引起如骨質疏松癥等疾病，破骨細胞在這類疾病中的作用非常關鍵[2]。目前發現，各型糖尿病使骨質疏松癥發病風險增高[3]。運用降糖藥物降低血糖后，骨折風險可明顯降低，這些降糖藥物中，二甲雙胍降低骨折風險最為明顯，且矯正了降糖的作用后，二甲雙胍仍具有降低骨折風險的作用[4]。目前的研究表明，二甲雙胍通過促進成骨細胞分化[5-7]，增強成骨細胞的功能來增加骨密度，然而二甲雙胍對破骨細胞的作用罕見有文獻報道。本課題組研究鹽酸二甲雙胍對破骨細胞分化及功能的作用，從而為骨質疏松癥提供潛在的治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-MEM 培養基和胎牛血清購自澳大利亞 TRACE 公司，RANKL、MCSF、TRAP試劑盒購自北京索萊寶公司，鹽酸二甲雙胍(純度>98%)購自美國Sigma公司。辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自美國santo cruz公司。抗ERK抗體購自美國cell signaling公司。骨吸收板購自美國BD公司。TRIZOL購買于美國invitrogen公司，Real-time PCR反應試劑SYBR?Premix Ex Taq購于大連TaKaRa。

1.2 細胞培養

分離取出C57BL/6小鼠股骨的骨髓巨噬細胞種于75 cm2的培養瓶中。培養瓶內含10 mL 10%胎牛血清的α-MEM培養基和25 ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)。于培養箱中培養3 d至后種于96孔板中，每孔6 000個細胞，含100 μL完全培養基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL。同時加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L)，每2 d換一次培養液，總共培養5 d。5 d后細胞固定30 min，加入抗酒石酸酸性磷酸酶染料(TRAP)染色15 min，然后用10倍鏡下數破骨細胞數量(對細胞核大于3的破骨細胞進行計數)。

1.3 破骨細胞骨吸收活性檢測

在6孔膠質板上用RANKL誘導C57BL/6小鼠骨髓巨噬細胞成為成熟的破骨細胞，消化獲取細胞后種于覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板上，每孔1×105個細胞，含2 mL完全培養基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(200、400 μmol/L)。培養48 h后，取一半細胞進行TRAP染色，另一半細胞用10%的漂白液洗去培養板上的細胞，然后用顯微鏡對骨吸收陷窩進行拍照，并用Image J 計算骨吸收面積。

1.4 破骨細胞基因檢測

用實時熒光定量PCR檢測破骨細胞特異基因。小鼠骨髓巨噬細胞接種于6孔板，每孔1×105個細胞，含2 mL完全培養基、25 ng/mL MCSF，以及50 ng/mL RANKL，并加入不同濃度的鹽酸二甲雙胍(100、200 μmol/L)。隔天換液，培養5 d，然后用TRIZOL裂解細胞。用1 μg 總RNA通過oligo-dT引物逆轉錄成cDNA，然后用SYBR?Premix Ex Taq于實時熒光定量RT-PCR儀進行實時熒光定量PCR反應，檢測破骨細胞基因的擴增情況。針對小鼠基因序列的引物設計如下：Cathepsin K(forward：5’-GGGAGAAAAACCTGAAG-3’；reverse： 5’-ATTCTGGGGACTCAGAGAGC-3’)；Calcitonin Receptor (forward： 5’-TGGTTG AGGTTGT GCCCA-3’；reverse：5’-CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3’)；TRAP (forward： 5’-TGT GGCCAT CTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3’)。實時熒光定量PCR反應的反應條件如下：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 40 s并進行30個循環，接著60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，最后72 ℃ 5 min。

1.5 Western blot 分析

小鼠骨髓巨噬細胞接種于6孔板，每孔1×105個細胞，含2 mL完全培養基、25 ng/mL MCSF，然后加入鹽酸二甲雙胍(200 μmol/L)處理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分別刺激0、5、10、20、30、60 min后棄去培養基，并提取細胞裂解液。然后用相應抗體檢測二甲雙胍對ERK磷酸化的影響。并用NBT/BCIP顯色，凝膠成像系統掃描成像，Image J分析蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件包進行數據分析。實驗組與各自的對照組進行兩兩比較，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞分化的影響

本實驗通過C57BL/6小鼠股骨分離出的骨髓巨噬細胞培養分化成破骨細胞并進行TRAP染色來進行研究鹽酸二甲雙胍對破骨細胞分化的影響。本實驗采用濃度為6.25～400 μmol/L的鹽酸二甲雙胍進行干預破骨細胞的分化。研究表明，鹽酸二甲雙胍能抑制破骨細胞分化，且這種抑制呈濃度依耐性。鹽酸二甲雙胍從50 μmol/L的濃度開始抑制破骨細胞分化，IC50在100 μmol/L(圖1)。

圖1 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞分化的作用 A：鹽酸二甲雙胍的分子結果(分子式：C4H12ClN5，分子量：165.6246)；B：不同濃度鹽酸二甲雙胍干預破骨細胞分化的細胞培養板的掃描圖片；C：100倍顯微鏡下觀察不同濃度鹽酸二甲雙胍干預破骨細胞分化；D：對鹽酸二甲雙胍干預的破骨細胞進行計數(對細胞核大于3的破骨細胞進行計數)。Fig.1 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast differentiation. A: The molecular structure of metformin hydrochloride (molecular formula: C4H12ClN5, molecular weight: 165.6246); B: The scanned picture of the cell culture plate interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; C: Microscopy (100×) observation of osteoclast differentiation interfered by different concentrations of metformin hydrochloride; D: Calculation of osteoclasts interfered by metformin hydrochloride (osteoclasts with cell nucleus≥3 will be calculated only).

2.2 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞功能的影響

鹽酸二甲雙胍對破骨細胞功能的影響通過覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板來進行研究。本實驗用鹽酸二甲雙胍干預破骨細胞骨陷窩的形成，然后用顯微鏡對骨吸收陷窩進行拍照，并用Image J計算骨吸收面積。結果表明，鹽酸二甲雙胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制骨吸收陷窩，且這種抑制呈濃度依耐性(圖2)，因此對破骨細胞的功能有抑制作用。

圖2 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞功能的作用，采用覆蓋有羥基石灰石的骨吸收板上分析鹽酸二甲雙胍對破骨細胞陷窩的作用Fig.2 The effect of metformin hydrochloride on the function of osteoclasts, hydroxyapatite-coated plates were applied for the study of the effect of metformin hydrochloride on osteoclast lacunae

2.3 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞特異基因的影響

本實驗用實時熒光定量PCR檢測鹽酸二甲雙胍對破骨細胞特異基因的影響。用不同濃度的鹽酸二甲雙胍(100、200 μmol/L)干預破骨細胞分化，然后檢測破骨細胞特異基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)的表達情況。結果表明，鹽酸二甲雙胍能在100 μmol/L及200 μmol/L抑制破骨細胞特異基因(Cathepsin K、Calcitonin Receptor、TRAP)，且這種抑制呈濃度依耐性(圖3)。該結果與鹽酸二甲雙胍對破骨細胞的分化及功能具有抑制作用的結果相符合。

圖3 鹽酸二甲雙胍對破骨細胞特異基因的作用Fig.3 The effect of metformin hydrochloride on osteoclast specific genes

2.4 鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的影響

本實驗用Western blot檢測鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的影響。鹽酸二甲雙胍(200 μmol/L)處理4 h，然后用50 ng/mL RANKL分別刺激0、5、10、20、30、60 min后棄去培養基，并提取細胞裂解液進行Western blot分析。結果表明鹽酸二甲雙胍能抑制ERK的磷酸化(圖4)。

圖4 鹽酸二甲雙胍對ERK磷酸化的作用Fig.4 The effect of metformin hydrochloride on the phosphorylation of ERK

3 討論

隨著世界人口的老齡化，骨質疏松癥已經成為影響全球人口生活質量和生命健康安全的重要疾病。因骨質疏松癥導致髖骨骨折患者1年內的死亡率可以提高8.4～36個百分點[8]。骨質疏松癥所導致的骨折給患者帶來極大的痛苦，給患者和家庭乃至整個社會帶來沉重的負擔。目前臨床上治療骨質疏松的藥物如雙膦酸鹽對胃腸道有較大的刺激；甲狀旁腺激素需每天經皮下注射，且費用昂貴；補充鈣劑和維生素D3對骨質疏松的療效并不明顯。因此，尋求抗骨質疏松療效顯著，副作用小，且能夠長期使用的藥物對改善骨質疏松癥患者的生活質量意義重大。

鹽酸二甲雙胍是目前治療糖尿病的一線藥物，具有高效性及低副作用性。目前的文獻報道鹽酸二甲雙胍除了降糖作用，還具有抗炎、抗腫瘤、降血脂及心臟保護等作用[9]。鹽酸二甲雙胍近來還被發現在糖尿病骨質疏松模型大鼠及糖尿病性骨質疏松癥患者中均具有抑制骨質疏松，提高骨密度，降低骨折風險的作用[10-11]。目前研究表明二甲雙胍通過促進成骨細胞分化，增強成骨細胞的功能來增加骨密度[5-7]，然而二甲雙胍對破骨細胞的作用罕見有文獻報道。本實驗表明鹽酸二甲雙胍隨濃度升高對破骨細胞的分化及功能具有抑制作用，該作用與抑制ERK磷酸化有關。綜上所述，本研究為鹽酸二甲雙胍應用于骨質疏松癥的治療提供了研究基礎和實驗依據。