清腸溫中方治療急性潰瘍性結腸炎大鼠的拆方研究

石磊 李軍祥 韓嘯 劉佳麗 路瓊瓊 寇富舜 孫中美 丁龐華 毛堂友 王志斌

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種慢性非特異性炎性結直腸疾病，主要影響18～50歲的中青年，有腹瀉、黏液膿血便和腹痛等癥狀。因本病難治愈、易復發、癌變風險高，UC已被世衛組織列為難治病。近年來，除常規治療藥物外，又新增了如：糞菌移植[1]、選擇性白細胞吸附[2]等技術手段，但以上藥物或療法具有療效不穩定、停藥后易復發、不同程度的毒副作用、價格較貴等問題。中醫藥在誘導緩解、協同西藥增效減毒、提高生活質量、預防復發等方面有較明顯優勢[3]。

清腸溫中方是課題組帶頭人李軍祥在繼承董建華院士學術思想下，根據多年臨床總結而成，特提出其病機屬脾陽不足、濕熱內蘊、瘀血內阻，治以溫中健脾、清熱燥濕、涼血化瘀。前期課題組在單中心的雙盲雙模擬RCT臨床觀察中發現，本方具有改善輕、中度活動期UC患者臨床癥狀、降低疾病活動度并提高生活質量的療效；動物實驗也證實了該方具有減輕炎癥、修復黏膜病變的作用。

為了進一步揭示本方的功效，本研究遵循“法依病機，拆方依法”的研究思路，將清腸溫中方根據病機拆分為：溫中健脾的炮姜、炙甘草；清熱燥濕的黃連、青黛、苦參；涼血化瘀的三七、木香、地榆炭，并將以上三者兩兩組合，開展清腸溫中方的拆方研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠79只，體重(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司(許可證號：SCXK(京)2016-0002)，常規飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，12小時光照/黑夜循環，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%，自由飲食飲水飼養。實驗過程符合北京中醫藥大學學術委員會實驗動物倫理分委員會制訂的倫理要求。

1.2 主要試劑儀器

葡聚糖硫酸鈉(0216011080，美國MP Biomedical)；大鼠IP10 Elisa試劑盒(CSB-E08182r，武漢華美生物工程有限公司)；大鼠CXCR3 Elisa試劑盒(JL13105，上海江萊生物科技有限公司)；小鼠抗HIF-1α單克隆抗體(ab1，美國Abcam)；小鼠抗Cytokeratin8單克隆抗體(ab9023，美國Abcam)；兔抗Vimentin單克隆抗體(ab92547，美國Abcam)；酶標儀(MultiSkan3；美國Therno scientific)；電泳儀(Mini Ge Tank，美國Therno scientific)；轉膜儀(Mini Blot Module，美國Therno scientific)；病理切片機(LEICA2016，德國Leica)；顯微鏡(XSP-C204，上海巨納科技有限公司)等。

1.3 實驗用藥

陽性對照藥：美沙拉秦緩釋顆粒(艾迪莎)，批號：170506，規格：0.5 g/袋。

中藥：清腸溫中方顆粒劑(黃連6 g、炮姜10 g、青黛3 g、苦參15 g、三七6 g、煨木香6 g、地榆炭15 g、炙甘草3 g)，由北京康仁堂公司生產加工，北京中醫藥大學東方醫院提供。

1.4 拆方分組

根據病機將清腸溫中方進行拆方、重組，具體分組：(1)溫中健脾組：炮姜、炙甘草，兩藥合用起到溫中健脾，溫補中焦之用；(2)清熱燥濕組：黃連、青黛、苦參，共奏清熱燥濕之效；(3)涼血化瘀組；三七、木香、地榆炭，功效涼血化瘀，行氣止痛；(4)溫中健脾合清熱燥濕組：炮姜、炙甘草、黃連、青黛、苦參；(5)溫中健脾合涼血化瘀組：炮姜、炙甘草、三七、木香、地榆炭；(6)清熱燥濕合涼血化瘀組：黃連、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭；(7)全方組：清腸溫中方全方，炮姜、炙甘草、黃連、青黛、苦參、三七、木香、地榆炭。

1.5 模型建立

所有大鼠于SPF級動物房適應性飼養1周后，將79只大鼠采用隨機數字表法進行完全隨機分組，共分10組，其中空白組7只，模型組、溫中健脾組、清熱燥濕組、涼血化瘀組、溫中健脾合清熱燥濕組、溫中健脾合涼血化瘀組、清熱燥濕合涼血化瘀組、全方組和美沙拉秦組，每組8只。除空白組外，其余大鼠連續7天自由飲用4%(w/v)葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液以建立急性UC模型，飲用結束后，按不同的分組分別灌胃給藥7天，與此同時，除空白組外的所有大鼠，仍需繼續服用1% DSS溶液以維持小劑量刺激引起的病變[4]。

1.6 分組給藥

本研究選用前期實驗中效果最明顯的中劑量為給藥劑量(即臨床患者口服用藥的等效劑量)[4]。在實驗的后7天，各組大鼠以相應藥物的中藥液或去離子水灌胃，每日1次，每次1 ml/100 g，具體用量：溫中健脾組：1.37 g 生藥/kg；清熱燥濕組：2.52 g 生藥/kg；涼血化瘀組：2.84 g 生藥/kg；溫中健脾合清熱燥濕組：3.89 g 生藥/kg；溫中健脾合涼血化瘀組：4.20 g 生藥/kg；清熱燥濕合涼血化瘀組：5.36 g 生藥/kg；全方組：6.72 g生藥/kg；美沙拉秦組：(美沙拉秦緩釋顆粒懸濁液)420.0 mg/kg。

1.7 標本取材

灌胃給藥的第7天，所有大鼠禁食不禁水24小時，灌胃7天后于第8天取材。取材當天稱重，按0.4mL/100g的劑量，腹腔注射10%水合氯醛溶液。腹主動脈抽取血液，靜置2小時后，4℃條件下3000 rpm離心15分鐘，留取淡黃色血清。留取數段腸管，PBS快速沖洗后，分別放于4%多聚甲醛和凍存管中，以進行病理和蛋白學相關檢測。

1.8 結腸組織病理學評價

結腸組織在多聚甲醛固定24小時以上，經過洗滌、修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片。二甲苯脫蠟、梯度酒精、蘇木精染色、分化、返藍、伊紅復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片，光學顯微鏡下觀察評分。根據結腸組織學病理學評分標準[5]計算總分。評分內容分炎細胞浸潤程度、肉芽腫和病變深度，無記0分，輕度記1分，中度記2分，重度記3分。

1.9 免疫組織化學染色

石蠟切片抗原修復、兩步法染色，DAB顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片。樣本在高倍鏡視野(×200)白平衡后進行拍照采圖，Image J軟件(National Institutes of Health, USA)分析圖像，計算光密度(IOD)和染色區域總面積(area)，IntDen表示陽性蛋白相對密度，以area表示陽性染色蛋白分布及表達總面積，用平均光密度(AOD=IntDen/area)統計分析。

1.10 酶聯免疫吸附實驗

凍存血清室溫解凍，按照Elisa試劑盒說明步驟進行操作。酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。

1.11 Western blot實驗

制備結腸組織勻漿、蛋白抽提、BCA定量、濃度調整、灌膠、上樣、電泳、轉膜、封閉、一抗反應、二抗孵育、顯影。以GAPDH為內參，Image J軟件定量，結果以目的條帶和內參的相對密度值表示。

1.12 統計學處理

2 結果

2.1 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠結腸黏膜組織學病變程度的影響

模型組可見炎細胞浸潤、腺體萎縮和黏膜結構破壞，治療后清熱燥濕、溫中健脾聯合清熱燥濕、溫中健脾合涼血化瘀、全方和美沙拉秦組均能緩解組織學病變并降低病變評分見圖1、表1。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖1 各拆方組大鼠HE染色組織學光鏡下腸黏膜組織病理圖(200×)

表1 各拆方組大鼠組織學病變評分表

2.2 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠腸黏膜中細胞骨架蛋白的表達影響

免疫組化染色發現，大鼠腸黏膜中波形蛋白(VIM)表達量較多，而模型組表達量更多，均成強陽性染色，從AOD值來看，除溫中健脾和溫中健脾合涼血化瘀組外，其余干預藥物均能減少其表達見圖2、表2。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖2 各拆方組大鼠腸黏膜中VIM蛋白的IHC染色圖(200×)

表2 各拆方組大鼠IHC染色值表

角蛋白8(K8)在各組大鼠腸黏膜中表達量整體偏低，模型組幾乎未見到陽性表達，治療后除清熱燥濕和清熱燥濕合涼血化瘀組，其余藥物均能促進表達，且與模型組比較，存在統計學差異。見圖3。

注：A：空白組；B：模型組；C：溫中健脾組；D：清熱燥濕組；E：涼血化瘀組；F：溫中健脾合清熱燥濕組；G：溫中健脾合涼血化瘀組；H：清熱燥濕合涼血化瘀組；I：全方組；J：美沙拉秦組。

圖3 各拆方組大鼠腸黏膜中K8蛋白的IHC染色圖(200×)

此外，VIM/K8比值在DSS誘導的急性UC模型大鼠中明顯升高，經各組藥物干預后，該比值均有下降見表2。

2.3 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠血清炎性介質的含量影響

Elisa檢測各組大鼠血清中干擾素γ誘導蛋白10(IP10)和趨化因子受體3(CXCR3)后發現，模型組大鼠二者均明顯升高，除涼血化瘀組外，各拆方組干預后均能明顯減少血清中兩種炎性介質的含量。其中，清熱燥濕、溫中健脾合涼血化瘀和溫中健脾合清熱燥濕組對IP10的下調作用更加明顯，效果優于全方和美沙拉秦；溫中健脾合涼血化瘀和清熱燥濕合涼血化瘀組則能更多地減少血清CXCR3含量，其下降作用略優于全方和美沙拉秦。見表3。

表3 各拆方組大鼠血清中炎性介質含量表

2.4 清腸溫中方拆方對急性UC大鼠結腸組織缺氧環境的影響

本研究采用Western blot檢測了各組大鼠結腸組織中的HIF-1α，結果發現雖然各組間不存在統計學差異，但模型組HIF-1α表達趨勢高于空白組，各拆方組在治療后也有減少的趨勢，其中，以全方組減少作用最為明顯，其次為溫中健脾合涼血化瘀和溫中健脾合清熱燥濕組。見圖4、表4。

注：A：模型組；B：空白組；C：美沙拉秦組；D：全方組；E：清熱燥濕組；F：涼血化瘀組；G：溫中健脾組；H：溫中健脾合清熱燥濕組；I：清熱燥濕合涼血化瘀組；J：溫中健脾合涼血化瘀組。

圖4 各拆方組大鼠結腸組織中HIF-1α蛋白印跡圖

表4 各拆方組大鼠結腸HIF-1α相對灰度值表[p50 (p25～p75) ]

3 討論

UC病位在腸，與脾胃關系密切；病性屬本虛標實，寒熱錯雜；本虛為脾陽不足，標實為濕熱內蘊夾有瘀血；病因病機或為外感濕熱，或為飲食不節，或為情志不暢，日久導致脾胃虛弱，運化失司，水濕內停，濕郁化熱，濕熱內蘊與腸道氣血相搏結，氣血凝滯，化為膿血，故見下利黏液膿血；腸道傳導失司，氣機阻滯，腑氣不通，出現腹痛、里急后重；脾胃虛弱，脾陽不足，溫煦失職，可有腹部冷痛，遇寒加重。

針對活動期UC，目前學術界多以清熱化濕和涼血止血為主要治療方法[6]，這一治法對泄瀉、便血類疾病雖是效如桴鼓，但由于UC發生時多已存在脾胃虛弱之況，一味使用苦寒、寒涼之藥只會徒增脾胃虛弱之累，甚至加重陽虛進程，這也是為何臨床中活動期UC患者常伴有怕涼畏寒的原因之一；此外，涼血止血雖然能治療一時出血之癥，但對濕熱與氣血博結，同時存在脾陽虛弱的情況，單純的止血只會加重氣血瘀滯之勢，進一步促使瘀血阻滯、新血不生，加重出血。因此結合臨床經驗，課題組帶頭人李軍祥提出活動期UC中，濕熱與瘀血貫穿疾病始終，同時伴有脾陽不足，應當治以清熱燥濕、涼血化瘀、溫中健脾，并創立了清腸溫中方，這一理念的提出，也完全符合唐容川在《血證論》中提出的“止血、化瘀、寧血、補虛”的治血四法。

角蛋白以酸堿配對的形式構成上皮細胞骨架中間絲，在腸上皮中主要表達為K8、K9、K19和波形蛋白(VIM)，不僅與各種結腸直腸疾病的發病有關，并且在維持上皮完整性方面發揮重要作用[9]。K8是上皮細胞早期分化的標志,研究發現UC患者K8表達顯著下調，可能導致UC患者腸道上皮層的分化受抑制,上皮層變薄而加重病情[10]。另有研究指出K8在急性期增加，當臨床和內鏡提示緩解時，其表達可有所恢復[11]。研究發現UC患者的病變組織中，巨噬細胞激活也可導致VIM分泌增多[12]。因此在與上皮剝蝕和隱窩萎縮的相關疾病中，潛在的細胞骨架表型可能會表現為VIM：K8比例逐漸上升。本研究發現，急性UC模型大鼠中VIM表達明顯增多，K8表達明顯低于空白組，VIM/K8比值顯著增高，這與報道的變化規律相一致，經拆方各組分干預后，均能顯著降低二者比值，且全方、溫中健脾合清熱燥濕和溫中健脾合涼血化瘀組的作用更加明顯。

IP10是內源性趨化因子，抑制IP10可以減輕IL-10-/-誘導的自發性結腸炎小鼠炎癥程度[13]。研究發現UC患者的血清和結腸中IP10含量顯著升高[14]；IP10 / CXCR3軸在兒童IBD的發病中，也起到重要作用[15]，因此提出，抑制IP10可能會緩解UC的臨床癥狀。CXCR3是IP10的特異性結合蛋白，一旦與IP10結合后則被激活，并有助于其轉移到炎癥局部進一步發揮效應。而腸黏膜局部炎癥產生的大量炎性細胞因子[16]，不僅能刺激IP10招募更多的炎癥細胞形成級聯反應，還能加重腸黏膜屏障的損傷。本研究發現拆方各組分(除涼血化瘀組)均能降低IP10和CXCR3在血清中的表達含量，涼血化瘀或清熱燥濕組本身對降低CXCR3的效果相對較弱，但在聯合了溫中健脾治法后，就能明顯發揮降低炎性介質的作用，發揮與全方相近的作用。

UC的出血和創面使血小板被大量激活，引起血小板黏附、聚集和高凝狀態；同時由于血管收縮、微血栓形成，造成整體和局部低氧的微環境，腸屏障功能受損[17]。此外，炎癥時局部血管通透性增強，更多的免疫細胞到達炎癥部位，加重炎癥部位的局部缺氧[18]。而在低氧環境下，HIF-1α的穩定性和轉錄活性都顯著增加[19]，最終導致UC黏膜中的高水平表達。本研究發現，雖然各組間尚不存在統計學差異，但UC模型鼠的HIF-1α表達增高，經藥物治療后，表達均有所減低，且以清熱燥濕合溫中健脾、涼血化瘀合溫中健脾及全方組的作用更為明顯，聯合組的藥效明顯優于單獨應用溫中健脾、清熱燥濕或涼血化瘀。

《靈樞·百病始生篇》有云“邪不能獨傷人……兩虛相得，乃客其形”，強調了正氣在發病中起的主導作用。當人體正氣不足，或邪氣的致病能力超過正氣的抗病限度時，導致疾病的發生，即所謂的“邪之所湊，其氣必虛”。扶正，就是通過藥物或其他療法扶助機體的正氣，以增強體質，提高機體抗邪能力的一種治療原則；祛邪，則是通過藥物或其他療法祛除或削弱病邪，減少邪氣侵襲和損害，達到邪去正安的目的[20]。一方面扶正可以扶益本源，調動人體的抗病能力并直接起到祛邪之用，所謂“養正則邪自安”；另一方面祛邪有利于扶正，只有祛除了病邪，正氣才可能迅速恢復，藥力才可能直達病所，所謂“閉門留寇”就是祛邪不足而成的，“瘀血去而新血生”也佐證了“邪去正安”的道理[21]。扶正祛邪是中醫治病的重要原則，二者是對立統一的，根據邪正消長及盛衰，決定治療的主次，扶正不留邪，祛邪不傷正，才能達到陰平陽秘的治療目標。

在本次拆方研究中發現，只采用清熱燥濕或涼血化瘀的祛邪治法，無法對UC發揮滿意的治療效果，無法對其病理環節起到充分的調節作用，但清熱燥濕或涼血化瘀在聯合了溫中健脾的扶正藥物后，無論是從修復細胞骨架、減輕炎癥、改善缺氧環境三個單獨的環節，亦或是從整體來看，都能發揮與全方相當的治療作用。因此也提示在潰瘍性結腸炎的中醫藥治療中，顧護正氣、溫中健脾是必不可缺的原則。