人參抗CINV的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究＊

劉成琳，孟 莉，王 靜，朱春璐，張會宗，袁子民

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 大連 116600；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 沈陽 110847）

化療是通過使用化學(xué)治療藥物殺滅癌細(xì)胞達(dá)到治療目的的方法，是目前治療癌癥最有效手段之一。化療藥物會損害體內(nèi)正常細(xì)胞，副作用明顯。例如，在服用化療藥物后不同時間內(nèi)可出現(xiàn)急性嘔吐、延遲性嘔吐和預(yù)期性嘔吐，嚴(yán)重影響患者的身體健康[1]。目前，臨床治療CINV 的藥物以西藥居多，多需聯(lián)合用藥，價格昂貴，副作用顯著，且不宜長久及大量使用。相比而言，中藥與化療藥物合用，通過整體調(diào)控和多因素調(diào)節(jié)，發(fā)揮協(xié)同抗癌作用，具有副作用小、價格低廉等優(yōu)點，引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。例如，Aung等[2]研究發(fā)現(xiàn)，西洋參中人參皂苷可增強順鉑的活性，人參皂苷除減弱化療引起的惡心嘔吐外，還可能與化學(xué)治療劑在治療癌癥中發(fā)揮潛在的補充作用。

人參味甘、微苦、微溫，具有“大補元氣，復(fù)脈固脫，補脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智”的功效[3]。《名醫(yī)別錄》中最早記錄了人參具有降逆止嘔的作用，人參抗CINV 的研究屬于中藥新功能挖掘的范疇。Mehendale等[4]研究表明，西洋參漿果提取物和人參皂苷Re 能夠有效抑制由順鉑引起的大鼠異嗜癖，并改善了正常食物的攝入。另外，Kim等[5]發(fā)現(xiàn)韓國紅參提取物能夠顯著減弱順鉑引起雪貂的惡心嘔吐；Sathyanath 等[6]用低劑量的韓國紅參皂苷部分和高劑量的非皂苷部分預(yù)處理大鼠，發(fā)現(xiàn)皂苷部分和非皂苷部分均可抑制由順鉑導(dǎo)致的大鼠異嗜癖。上述西洋參、韓國紅參與人參同屬五加科植物，對人參抗CINV 研究具有一定的啟示作用。實驗前期，通過人參止嘔文獻(xiàn)考證[7]及大鼠異嗜高嶺土模型實驗，初步證實人參原粉具有抗CINV 的作用[8]。現(xiàn)代研究表明，人參皂苷Rg3可通過上調(diào)LOVO 細(xì)胞E－cadherin 蛋白表達(dá)，抑制腸癌細(xì)胞LOVO 增殖[9]；人參皂苷Rg3可刺激Th1細(xì)胞表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2比例，提高患者免疫力，達(dá)到抗腫瘤[10]作用；人參皂苷Rh2具有誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌凋亡的能力[11]；小劑量人參多糖可抑制人肝癌BEL-7402 細(xì)胞生長[12]。佟彤等[13]發(fā)現(xiàn)，人參多糖能夠有效逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺造成的T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+/CD8+比例減小，CD69+細(xì)胞CD3+T細(xì)胞比例升高，提高人體免疫力，抑制腫瘤。上述研究表明，人參與化療藥物合用，抗CINV 同時，其化學(xué)成分人參皂苷和多糖可通過抑制腫瘤，提高人體免疫力，同化療藥物發(fā)揮著協(xié)同抗癌作用，達(dá)到攻補兼施、標(biāo)本兼治的目的。

為進(jìn)一步明確人參抗CINV 作用的活性組分，本實驗采用順鉑致大鼠異嗜高嶺土模型，對人參不同極性溶媒提取物進(jìn)行抗CINV 作用研究。同時，繪制不同極性提取組分的HPLC 指紋譜，通過譜-效相關(guān)分析，初步確定人參抗CINV 的活性成分，為人參抗CINV的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制分析提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

本實驗采用島津LC-2010HT高效液相色譜儀，包含LCsolution 化學(xué)工作站、VWD 檢測器、自動進(jìn)樣器（日本島津有限公司）。

人參購于亳州千草藥業(yè)有限公司，經(jīng)遼寧省中醫(yī)藥研究院張會宗研究員鑒定為五加科植物人參PanaxginsingC. A. Meyer.干燥的根及根莖；人參皂苷Rg1、Rb1、Re（中國食品藥品生物制品檢定研究院，批號分 別 為110703-201832、110704-201827、110754-201827，供含量測定用。）；鹽酸昂丹司瓊注射液（齊魯制藥有限公司，批號：7K04141016）；注射用順鉑（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號：180201）；高嶺土（上海源葉生物科技有限公司，批號：20181017）；D101 型大孔吸附樹脂（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20170622）；水為純凈水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 動物

SPF 級昆明種大鼠，雄性，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。

2 方法

2.1 人參水提液及不同極性提取物的制備

精密稱取人參粗粉200 g，置圓底燒瓶中，加10 倍量水，加熱回流2 h，得到水煎液，藥渣繼續(xù)同上操作，加8 倍量水，加熱回流2 h，藥渣繼續(xù)同上操作，加6 倍量水，加熱回流2 h，合并濾液，濃縮至1000 mL，得人參水提液。取人參水提液加入乙醇使其水提液的乙醇濃度達(dá)到80%，在4 ℃下放置過夜，抽濾得沉淀物，烘干，即得醇沉組分；將濾液回收乙醇至無醇味，通過D101型大孔吸附樹脂，依次用水、60%乙醇、90%乙醇洗脫，分別收集相應(yīng)洗脫液，減壓回收溶劑，得不同極性提取物，分別加水適量使各不同極性提取的濃度相當(dāng)于生藥量1 g/mL。

2.2 人參水提液及不同極性提取物抗CINV 的活性研究

2.2.1 大鼠適應(yīng)性實驗

高嶺土飼料是由高嶺土加10%阿拉伯膠溶液制備而成，其形狀與大鼠正常飼料相似。實驗前對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，將正常飼料與高嶺土飼料等量后，同時給予大鼠，并每天定時將飼料取出稱重，至大鼠不在啃食高嶺土為止，進(jìn)入正式實驗。

2.2.2 順鉑劑量對大鼠異嗜高嶺土模型的影響

將大鼠隨機分為4 組，每組6 只，第1 組灌胃生理鹽水10 mg/kg作為空白對照，第2～4組腹腔注射順鉑，順鉑劑量分別為3 mg/kg、5 mg/kg 和7 mg/kg。觀察各自在給予順鉑后96 h 內(nèi)大鼠異嗜高嶺土行為，并計算每只大鼠每天內(nèi)高嶺土和正常飼料攝入量，結(jié)果見圖1。

2.2.3 人參水提液及不同極性提取物的止嘔作用研究

將大鼠稱重，隨機分為8 組，每組8 只，分為空白對照組、模型對照組、水提液組、醇沉組、水沖洗組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組、鹽酸昂丹司瓊組。人參不同極性提取物按5 g/kg 給藥，鹽酸昂丹司瓊組按2 mg/kg 給藥。每天給藥一次，連續(xù)六天，空白對照組和模型對照組按體重給予等容積的蒸餾水。于第三天給藥后30 min，除空白對照組外，其余各組腹腔注射順鉑5 mg/kg，記錄各組給藥后96 h內(nèi)高嶺土和正常飼料攝入量以及體重的變化，并計算每只大鼠每天高嶺土和正常飼料攝入量以及體重的變化，結(jié)果見圖2和圖3。

2.3 人參不同極性提取物指紋圖譜建立及譜效相關(guān)研究

2.3.1 色譜條件

譜柱：Diamondil TM（鉆石）C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速；1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫：30 ℃；流動相A 為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，二元線性梯度洗脫0～30 min：81% B (19%A)；30～35 min 81→76% B (19→24%A)；35～60 min 76→60% B (24→40%A)。

2.3.2 人參不同極性提取物供試品溶液的制備

精密量取人參不同極性提取物的水溶液適量（相當(dāng)于人參藥材1 g），置于10 mL 量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，得濾液。

2.3.3 對照品溶液制備

取對照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含人參皂苷Rg10.2172 mg、人參皂苷Re 0.1990 mg、人參皂苷Rb10.2002 mg 的混合對照品溶液。

2.3.4 人參不同極性提取物指紋圖譜測定

分別精密量取“2.3”項下的各供試品20 μL，用高效液相色譜分析，獲得人參不同極性提取物的指紋圖譜，結(jié)果見圖4。

2.3.5 譜效相關(guān)研究

利用SPSS19.0 軟件對指紋圖譜不同色譜峰面積和藥效學(xué)指標(biāo)分別進(jìn)行相關(guān)分析與回歸分析，確定人參抗CINV的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié)果

3.1 順鉑劑量的選擇

各劑量順鉑均能引起大鼠明顯異嗜高嶺土行為，并抑制大鼠飼料攝入量，與空白對照組比有顯著性差異，但實驗結(jié)束后發(fā)現(xiàn)順鉑7 mg/kg 劑量組，大鼠有死亡現(xiàn)象，且死亡率達(dá)到了50%，因此選擇順鉑5 mg/kg為造模劑量，如圖1。

圖1 順鉑劑量的選擇（±s，n=8）

3.2 人參水提液及不同極性提取物的止嘔作用結(jié)果

人參水提液組、60%乙醇洗脫組可均抑制順鉑所致的嘔吐，與模型對照組對比具有顯著性差異（P≤0.05），主要表現(xiàn)為大鼠異嗜高嶺土飼料減少，醇沉組分、水洗脫組分、90%乙醇洗脫組分無顯著性差異（P＞0.05）。如圖2。

圖2 人參不同極性提取物對大鼠異嗜高嶺土情況（±s，n=8）

3.3 人參不同極性提取物指紋圖譜與藥效學(xué)研究

3.3.1 人參不同極性提取物指紋圖譜制定

人參不同極性提取物的指紋圖譜中如圖4，共指認(rèn)出11個色譜峰，分別標(biāo)記為X1～X11。

圖3 96 h內(nèi)大鼠體重變化（±s，n=8）

3.3.2 相關(guān)分析

本實驗采用SPSS19.0 版統(tǒng)計軟件對藥理結(jié)果和11個色譜峰面積進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，得到二者的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。由表1 可知，與高嶺土攝入量相關(guān)的色譜峰有X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11。

3.3.3 回歸分析

采用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件，對11個色譜峰面積和藥理結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，得到回歸方程，其中X1、X8、X10被引入回歸方程，標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程為：Y=-1.367×10-6X8-3.059×10-8X1-5.499×10-7X10+5.301。

圖4 人參不同極性提取物的HPLC指紋圖譜

表1 11個色譜峰面積與高嶺土攝入量皮爾遜相關(guān)系數(shù)

綜合相關(guān)分析和回歸分析可得，色譜峰X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11與大鼠異嗜高嶺土顯著負(fù)相關(guān)，與藥效預(yù)期結(jié)果一致。在回歸分析中X1、X8、X10被引入回歸方程，提示X1、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11可能是人參抗CINV 的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中X3、X4、X8分別為人參皂苷Rg1、Re、Rb1。

4 討論

化療藥物引起食欲減退、惡心納差、脘腹脹痛，重者劇烈嘔吐、難以進(jìn)食、腹痛腹瀉，甚至出現(xiàn)血性腹瀉等消化道反應(yīng)，是最常見的毒副作用[14-15]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃主受納運化，乃人體后天之本，氣血生化之源，如能完成水谷的運化，患者機體就能得到充足養(yǎng)分抵抗化療藥物對機體正常細(xì)胞的損害，完成化療[16-17]。為此，化療的同時，注意保護胃氣、調(diào)理中焦，使胃氣盛、氣血旺，顯得尤為重要，故臨床常用人參健脾湯、六君子湯等進(jìn)行調(diào)理。另外，參麥注射液能提高腫瘤病人的免疫功能，與化療藥物同用，具有增效作用，能改善患者健康狀況，保護和提高骨髓造血功能，增強腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能，提高腫瘤縮小率，達(dá)到解毒增效的目的[18]。據(jù)文獻(xiàn)報道[19]，用人參注射液治療32例癌癥患者化療所致白細(xì)胞下降，總有效率達(dá)到87.5%。這表明人參能防止多種原因引起的白細(xì)胞下降，增強機體免疫力，降低藥物化療的不良反應(yīng)。

在研究嘔吐實驗時，常采用動物模型，包括雪貂、狗和大鼠，每種模型都與一些限制因素相關(guān)，例如成本、處理動物的容易程度、沒有嘔吐中心以及無法嘔吐[20-21]。本實驗采用大鼠異嗜高嶺土模型觀測人參不同極性提取物治療CINV 的效果。實驗大鼠雖缺乏催吐反射弧的運動成分，不能產(chǎn)生嘔吐，但大鼠對順鉑、嗎啡、放射線和模擬暈動病引起的惡心嘔吐，可通過增加非營養(yǎng)物質(zhì)如高嶺土的攝入（異食癖）來響應(yīng)惡心嘔吐刺激[4,21]。本實驗給藥后30 min 注射順鉑，發(fā)現(xiàn)大鼠精神狀態(tài)較空白對照組差，推測可能為中藥起效慢的結(jié)果，后調(diào)整為連續(xù)三天給藥后再注射順鉑；順鉑劑量篩選過程發(fā)現(xiàn)，高劑量組有一定的致死率且高嶺土和飼料攝入量與低、中劑量組比無顯著性差異（P＞0.05），其中低、中劑量組無死亡且與空白對照組比較，高嶺土攝入量顯著增多。綜合分析選擇中劑量5 mg/kg為順鉑造模劑量。大鼠異嗜高嶺土實驗顯示，人參水提液和60%乙醇洗脫組分均具有抗CINV 作用（P≤0.01）；醇沉組分、水洗脫組分、90%乙醇洗脫組分抗CINV 作用不顯著（P＞0.05）。其中60%乙醇洗脫部分主要為人參皂苷，醇沉組分為多糖，表明人參抗CINV 作用的主要成分為皂苷類。同時人參水提液組、醇沉組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組可顯著降低由順鉑引起的體重減輕，推測可能與人參皂苷和多糖增強機體免疫力和適應(yīng)原作用相關(guān)。實驗中每組大鼠的飼料攝入量均無顯著性差異（P＞0.05），推測可能與順鉑抑制胃排空有關(guān)[2]。

預(yù)實驗對HPLC 指紋譜的檢測波長、流動相進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在203 nm 處檢測，色譜峰較多，乙腈-0.1%磷酸緩沖液梯度洗脫系統(tǒng)較甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)的基線漂移小，在該梯度洗脫條件下更利于色譜峰的分離，并結(jié)合《中華人民共和國藥典》一部“人參”項下人參總皂苷特征圖譜的測定方法，確定了實驗HPLC指紋譜的色譜條件[3]。

本實驗采用雙變量相關(guān)分析和逐步回歸分析，初步推測10個色譜峰與人參抗CINV的相關(guān)性。通過與對照品比對，確定了X3、X4、X8色譜峰分別為人參皂苷Rg1、Re、Rb1。上述三個化學(xué)成分與有關(guān)文獻(xiàn)報道的抗腫瘤、增強免疫功能相協(xié)同；其他7個化學(xué)成分有待進(jìn)一步鑒別，10個化學(xué)成分之間是否存在協(xié)同作用也有待進(jìn)一步確證。