扶正祛邪抑癌方治療大鼠原發性肝癌的實驗研究＊

雷 丹，黃素瓊，李 波，王曉棟，劉友平，魏 嵋

（1. 西南醫科大學附屬中醫醫院 瀘州 646000；2. 西南醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室 瀘州 646000）

我國每年約30 萬-40 萬人死于肝癌，約占全球肝癌死亡人數的50%[1]。而原發性肝癌（Primary liver cancer，PLC）起病隱匿，早期缺乏典型的臨床表現，位居我國癌癥死亡率第二位。癌癥最常發生在慢性炎癥環境中[2]，通過轉錄因子介導炎癥介質產生，包括趨化因子和細胞因子。細胞因子激活炎性細胞、基質細胞和腫瘤細胞中的相同關鍵轉錄因子，導致產生更多的炎癥介質并產生癌癥相關的炎性微環境。病毒感染、飲酒、藥物、細菌等情況下，巨噬細胞的活化以及大量炎癥因子參與肝臟慢性炎癥環境的形成，導致肝癌的發生，并且大量促炎因子為腫瘤生長提供優勢環境[3-4]。

扶正祛邪抑癌方是我院全國名中醫孫同郊教授幾十年治療肝癌的臨床經驗總結，臨床應用收效甚佳，主要針對臨床上肝癌常見的氣陰兩虛，瘀毒互結的證型，該方由黃芪、枸杞子、女貞子、白術、土鱉蟲、丹參、莪術、半枝蓮、香附等十余味藥物組成。方中重用黃芪、枸杞子為君藥，注重氣陰雙補，臣以白術健脾益氣、女貞子養肝腎之陰，以上藥物共建扶正之基。半枝蓮性苦、微寒，有清熱解毒、活血化瘀之功；土鱉蟲、莪術等藥物具有破血逐瘀、消積止痛的功效；香附為使，疏肝理氣，引藥入經，諸藥合用，共奏益氣養陰、活血化瘀、清熱解毒之效。

本實驗通過扶正祛邪抑癌方干預二乙基亞硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）導致的PLC 大鼠，通過檢測肝功及相關細胞因子評估該方的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品試劑及主要儀器

實驗動物、藥品、試劑：清潔SD 雄性大鼠200 只，由西南醫科大學實驗動物中心提供。扶正祛邪抑癌方由我院制劑室統一制作為濃縮膏，每毫升含生藥1.5 g,其中黃芪、白術等采用水提法，枸杞子、女貞子、土鱉蟲、香附等藥物采用醇提法。復方斑蝥膠囊：貴州益佰制藥股份有限公司，批號：Z52020238，0.25 g/粒。試劑：DEN：美國sigma 公司，0.95 g/mL。γ-谷氨酰轉肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）、天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）試劑盒：南京建成生物工程研究所。白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（Interleukin-10，LI-10）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFNγ）：茁彩生產。環氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）多克隆抗體proteintech中國武漢。

主要儀器：臺式高速冷凍離心機（Eppendorf 5424R）、全自動雪花制冰機（常熟市學科電器有限公司）、AU 2700全自動生化分析儀（日本Olympus）、酶標儀Multlskan MK3(賽默飛世爾儀器有限公司生產)。

1.2 方法

造模：清潔雄性SD大鼠200只，體質量150-180 g，適應性喂養1 周后，隨機分為兩組，正常組20 只，干預組180 只，正常組予以生理鹽水2 mL/kg 腹腔注射；干預組予以DEN 腹腔注射，50 mg/kg，每周1次。至第13周開始，每周處死模型組大鼠2只，取肝臟行HE染色，至第17 周末病理學檢查證實PLC 造模成功。造模成功后正常組剩余18 只，干預組剩余130 只，將干預組隨機分為模型組、斑蝥組、高劑量組、中劑量組和低劑量組共5組。正常組、模型組予以生理鹽水灌胃，斑蝥組予以復方斑蝥膠囊灌胃,低、中、高劑量組分別予以扶正祛邪抑癌方浸膏5 mL/kg、10 mL/kg、20 mL/kg，等體積稀釋后進行灌胃。

指標檢測：灌胃觀察12 周后計算大鼠生存率，腹腔注射10%的水合氯醛0.3 g/kg，腹主動脈采血，并取肝脾組織，進行相關指標檢測。通過全自動生化儀檢測γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）；Elisa檢測白介素-6（IL-6）、白介素-10（LI-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）；免疫組化檢測AFP、COX-2。

2 統計學處理

統計軟件SPSS 20.0用于數據的統計分析。

統計描述性分析：①計數資料以頻數表示；②計量資料以均數±標準差表示。

各組間差異比較：①多組計量資料以單因素方差分析進行檢驗；多重的組間比較以LSD 檢驗進行；②計數資料采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05，當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 DEN對SD大鼠原發性肝癌造模

造模17周后，取大鼠肝臟行HE染色：可見肝細胞變性壞死，局部區域腫瘤形成，腫瘤細胞周圍大量纖維組織增生形成包囊，證明肝癌造模成功。見圖1。

3.2 取材時肝臟大體觀

肉眼觀察：正常組大鼠肝組織質地柔軟，顏色淡紅,表面光滑,邊緣銳利；模型組大鼠肝臟表面見彌漫性結節，存在結節出血，肝葉之間黏連不清，結節間正常肝組織少；低劑量組大鼠肝臟可見彌漫性結節或散在結節，結節較大，并且有相互融合，部分可見結節內出血；中劑量組肝臟見多發結節，但在結節數量及大小較其余各給藥組明顯好轉；高劑量組大鼠肝臟表面散在多個較大的結節，結節之間存在彼此融合，部分可見結節內出血情況；斑蝥組大鼠肝臟結節大小不一，結節數量較模型組減少，與中劑量組最接近。見圖2。

3.3 取材時肝臟組織病理檢查

肝組織HE染色,鏡下觀察可知，正常組：大鼠肝小葉、細胞形狀結構正常，大小均勻、邊界分明、呈放射狀整齊排列。模型組：肝索排列紊亂，肝細胞變性壞死。局部區域腫瘤形成，大量異形細胞增生，腫瘤細胞排列密集，分化程度低，異形性大，部分腫瘤細胞內可見多個細胞核，細胞間可見大量增生纖維組織，腫瘤內部呈片狀壞死，局部區域亦可見灶狀炎細胞浸潤，血管增生明顯。低劑量組：與模型組相比，肝細胞壞死程度稍減輕，腫瘤細胞排列相對疏松，腫瘤細胞壞死程度稍減輕。中劑量組：與模型組相比，腫瘤細胞分化程度高，排列緊密，類似肝細胞，體積較大，腫瘤細胞壞死不明顯。高劑量組；與模型組相比腫瘤細胞分化程度高，腫瘤細胞壞死好轉。斑蝥組：與中劑量組基本相似。見圖3。

圖1 大鼠肝臟行HE染色（*100）

圖2 肝臟大體觀

圖3 肝組織HE染色（*100）

3.4 各組大鼠一般情況、生存率比較

在灌胃過程中，除正常組外，各組大鼠均出現不同程度的生長緩慢或體質量下降、精神差、怠動，毛色晦暗無光澤等情況，但總體而言，正常組＞中劑量組＞高劑量組/斑蝥組＞低劑量組＞模型組。各組大鼠生存率與模型組相比有增加趨勢，其中模型組與中劑量組差異具有統計學意義（P＜0.05）（見表1、表2和圖4）。

表1 大鼠生存率比較

表2 大鼠死亡數量與時間關系表

圖4 生存曲線圖

3.5 體質量、肝臟指數、脾臟指數

3.5.1 體質量

如表3、圖5 和圖6 所示，在大鼠開始灌胃時，除正常組外，各組大鼠體質量接近，差異無統計學意義。至灌胃第13周取材時體質量分析發現：正常組大鼠與其余各組差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與斑蝥組、高劑量組、中劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），與低劑量組比較差異無意義。

3.5.2 肝臟指數、脾臟指數情況

如表4 和圖7 所示：與正常組相比，各組大鼠肝臟、脾臟指數明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組的肝臟、脾臟指數均有不同程度下降（P＜0.05），其中以中劑量組下降最明顯。

表3 大鼠體質量變化表（單位：g）

圖5 大鼠體質量變化曲線圖

圖6 各組大鼠體質量比較

表4 肝臟、脾臟指數比較表

3.6 檢測肝功能指標

檢測ALT、AST、ALP、GGT結果示：與正常組相比，各組ALT、AST、ALP、GGT都明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組均可以不同程度降低ALT、AST、ALP、GGT，差異具有統計學意義（P＜0.05），其中中劑量組改善以上指標最顯著，低劑量組肝功能與模型組最接近。與斑蝥組相比，中劑量組改善AST、ALP、GGT效果更好(P＜0.05)（見表5和圖8）。

圖7 肝臟指數、脾臟指數比較

表5 大鼠肝功能（ALT、AST、ALP、GGT）比較

圖8 各組ALT、AST、ALP、GGT比較

表6 血清細胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）比較

圖9 各組IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 比較

3.7 細胞因子

通過Elisa 檢測IL-6、IL-10、TNF-α與IFN-γ結果（見表6 和圖9）所示：與正常組相比，各組的IL-6、IL-10、TNF-α均明顯增高(P＜0.05)。與模型組相比，各給藥組均可以不同程度降低IL-6、TNF-α（P＜0.05）,斑蝥組、高劑量組、中劑量組可以降低IL-10（P＜0.05），以中劑量組降低最為明顯。且中劑量組降低IL-6、TNF-α的作用優于斑蝥組（P＜0.05）。與正常組相比，斑蝥組、中劑量組IFN-γ都有所升高（P＜0.05）。與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組均可以升高IFN-γ（P＜0.05）。

3.8 免疫組化檢測肝組織COX-2、AFP的表達

免疫組化COX-2、AFP，陰性細胞呈藍色，陽性細胞呈黃色或棕黃色，AFP、COX-2 陽性產物主要分布在細胞漿。結果如表7、圖10、圖11和圖12所示：與正常組相比，各組COX-2、AFP 光密度值明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，斑蝥組、高劑量組、中劑量組的AFP、COX-2 光密度值有所下降（P＜0.05），以中劑量組降低最明顯，且中劑量組降低AFP 效果優于斑蝥組（P＜0.05）。

4 討論

圖10 大鼠肝臟組織中AFP、COX-2 OD值比較

圖11 大鼠肝組織AFP的表達（*400）

圖12 大鼠肝組織COX-2的表達（*400）

通過查閱相關文獻，本實驗對SD 大鼠予以DEN 50 mg/kg每周一次腹腔注射[5]。在以往報道中，對于造模時間存在13-18周不等[6-8]，造模時間難以把握，故本實驗自第13 周末開始每周取2 只大鼠肝臟行病理檢查，至第17周證實大鼠肝癌誘導成功。

表7 AFP、COX-2光密度值比較

丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate transaminase，AST）主要存在于肝細胞中，是最常用的肝細胞破環和肝功能受損的指標。急慢性肝炎或肝硬化等慢性肝病中，ALT、AST 都會升高；堿性磷酸酶（Alkaline phospbatase，ALP）是主要分布于肝臟、骨骼、腸、腎等組織，經肝臟向膽外排出的一種酶，血清中γ-谷氨酰轉肽酶（Gamma-glutamyl transpeptidase，GGT）主要來自肝臟，肝癌時會出現GGT、ALP 過多產生及排泄障礙，故目前臨床上肝癌患者大多存在ALP、GGT 明顯升高。有動物實驗發現[9]，DNE 誘發大鼠PLC 的過程中，GGT 可被作為肝細胞變異的陽性標志，并且隨著腫瘤的增大，GGT 會不斷升高。目前研究中多把GGT、ALP 聯合腫瘤標志物作為肝癌診斷的重要依據[10-11]。本實驗觀察到大鼠ALT、AST、ALP、GGT 有不同程度升高，說明DEN 導致的原發性肝癌大鼠存在肝功能損傷，且各組大鼠中AST/ALT＞1，因本實驗中對肝癌大鼠觀察時間為12 周，大鼠處于肝癌晚期，肝細胞穩態被打破，線粒體破壞，大量AST 釋放。使用藥物治療后，各組大鼠肝功能指標與模型組相比均有不同程度改善，以中劑量組改善以上指標更明顯。本研究認為，扶正祛邪抑癌方全方具有益氣養陰，活血化瘀，清熱解毒的作用，針對肝癌過程中的虛、瘀、毒的病理特點，從而達到改善以上指標的效果；另外現代藥理研究中發現方中黃芪、白術、莪術等多種藥物具有抗腫瘤、改善肝功能的效果。

慢性炎癥通過提供炎癥因子等生物活性物質促進腫瘤發生或誘導樹突狀細胞產生免疫抑制因子誘導腫瘤發生，并且保護癌細胞免受免疫攻擊[12]。在HCC 中，病毒成分或炎性細胞因子，如TNF-α，通過酪氨酸激酶型受體起作用的生長因子，增強了HCC 細胞中p-SMAD3L（Ser-213）及其靶基因MMP-9的水平[13]。多項研究證實，TNF-α可以促進肝癌細胞轉移[14-15]。IL-6是炎癥反應中重要的細胞因子，IL-6與IL-6受體結合后可以通過IL-6/JAK2/STAT3、Ras/Erk 和PI3K/AKT等多條通路發揮其致癌活性[16]，有研究表明其IL-6 可促進腫瘤生長[17]。IL-10 是目前公認的炎癥免疫抑制因子，被認為在腫瘤微環境中通過減少抗腫瘤免疫反應使腫瘤逃避免疫[18]。通過抑制促炎細胞因子的產生，下調共刺激分子以及主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)II 類的表達來抑制抗原呈遞細胞（APCs）和T 細胞功能，被認為有助于免疫抑制環境，從而促進腫瘤逃逸[18-20]，葉韻斌等[21]在分析PLC 組織中細胞因子的表達中發現肝癌組織中IL-10 明顯高于非癌組織。IFN-γ由自然殺傷細胞(NK細胞)和活化T細胞產生，具有抗腫瘤、抗病毒及調節免疫等作用。COX-2催化產物PGE2與腫瘤細胞上前列腺素受體結合，通過激活細胞內PI3K/Akt/mTOR信號，促進細胞增殖[22]，在臨床研究中發現，抗腫瘤血管生成藥物可誘導腫瘤組織缺氧，缺氧期間COX-2的上調并通過不同的VEGF 途徑誘導血管生成，有研究發現加用COX2 抑制劑有助于克服子宮內膜癌、直腸癌等在治療過程中的耐藥[23-24]。

在實驗中發現，與模型組相比，扶正祛邪抑癌方各劑量組，特別是中劑量組（等效藥物劑量），能夠降低血清中的IL-6、TNF-α、IL-10 水平，升高IFN-γ水平，降低肝臟組織中AFP、COX-2 的表達。因扶正祛邪抑癌方注重扶正解毒，研究證明方中黃芪、白術、土鱉蟲等藥物可以抗腫瘤、提高機體免疫功能，本研究認為可能是該方在一定程度上抑制了過度的炎癥反應，提高了機體免疫水平，減少腫瘤細胞的逃逸，從而達到抗癌的效果。

在本實驗中，使用扶正祛邪抑癌方低劑量、中劑量和高劑量進行灌胃，其中中劑量為等效藥物劑量，實驗證明其效果最佳。中醫治病講究的是辯證論治，根據疾病的病因病機，遵循“寒者熱之”“熱者寒之”“虛則補之”“實則瀉之”等用藥原則，但是若劑量過大則可能出現調整太過，從而效果欠佳，或者出現不良反應，故出現高劑量組效果不如中劑量組。所以在臨床使用扶正祛邪抑癌方時，不宜在加大使用藥物劑量。

綜上所述，一定劑量的扶正祛邪抑癌方可以t 提高DEN 所致的原發性肝癌大鼠的生存率，改善其肝功能，調節大鼠體內細胞因子水平，降低肝臟組織中AFP、COX-2水平，從而對肝癌有一定治療作用。