基于網絡藥理學探討乳香
——沒藥藥對干預乳腺增生癥的分子機制＊

葛安琪，楊凱麟，劉麗芳，曾柳庭，范洪橋

（1. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2. 湖南中醫藥大學 長沙 410208）

乳腺增生癥（Hyperplasia of Mammary Gland,HMG）的臨床癥狀主要表現為周期性的乳腺脹痛，經期來臨前和情緒郁結時加重[1-2]，占比乳腺疾病的三分之二以上，是中青年女性最常見的乳腺疾病，育齡婦女發病率中約占50%。快生活節奏導致發病人數逐年攀升[2-4]，我國育齡期婦女的檢出率為15%-22%[5]。盡管乳腺增生癥的發展與乳腺癌仍然缺少關聯性證據，但乳腺癌的患者常常合并乳腺增生，隨著時間的推移，乳腺增生癥發展成乳腺癌的可能性也越來越大[6-8]。目前較為公認的發病機制主要與內分泌功能紊亂密切相關。該病癥的健康管理主要包括心理治療、西藥治療、手術治療、中醫中藥治療等[9-10]，但長期口服藥物治療會產生機體激素水平紊亂和各種用藥不適，加劇乳腺增生的程度[11]。中醫中藥治療是目前臨床效果和使用最常見的管理策略，中藥內服在治療乳腺增生癥取得了良好的效果，并且由于經濟、安全、無副作用己被廣大患者接受[12-13]。

王春暉通過對中國知網和萬方數據庫進行檢索，總結治療乳腺增生病的中藥外治法用藥規律發現：乳腺增生病中藥外治法中使用頻次最高的3 味藥是乳香、沒藥、冰片；“乳香和沒藥”“乳香和冰片”等則是最常用的藥對[14]。更多的臨床研究發現，西黃丸治療乳腺增生具有較好的療效[15-17]，且乳香-沒藥藥對是西黃丸的主要構成[18]。乳香、沒藥同為活血化瘀類中藥，乳香性溫，沒藥性平，二者皆味辛、苦，氣芳香，入心、肝、脾經，具有活血散瘀、消腫止痛功效，兩者作為經典的活血化瘀藥在乳腺增生的治療中經常出現，發揮了良好的效果，但其作用機制仍然不清楚。網絡藥理學為本研究提供了新的工具，其主要基于系統生物學、計算機生物學，透過網絡的構建以及網絡拓撲學的屬性對藥物的靶點進行探索[19-26]。無論是疾病發生發展還是藥物研發，以往的模式采用的是還原論的研究方法，但是臨床上的多種疾病往往都具有多靶點交叉作用的疾病，針對單一的靶點往往無法達到治療的目的，且帶來了眾多的副作用和低的治療依從性，乳腺增生癥作為一種復雜的內分泌的疾病，通過網絡藥理學的工具也將是最佳探索中藥復方對乳腺增生的工具。本文試圖通過網絡藥理學方法解釋乳香-沒藥藥對治療乳腺增生癥的分子機理。.

1 材料與方法

1.1 活性成分化合物的篩選

乳香-沒藥藥對的化合物從TCM@Taiwan 數據庫[27-31]、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）數據庫[27-30,32]和TCMID 數據庫（https://academic.oup.com/nar/article/41/D1/D1089/1057998）[25]中選取。為避免遺漏，還結合了乳香-沒藥藥對相關實驗研究[33-35]。中草藥中的活性成分的組合構成了治療疾病的物質作用基礎，同時多組分的成分中大部分藥物通過吸收入血才能保持有效的作用成分，從而發揮生理作用，因此，通過中藥活性組分吸收、利用、代謝的藥代動力學原理以及多成分多結構的特性，本研究采用了生物利用度（OB）、Caco-2 滲透性和類藥性（DL）這三個參數來對中草藥化合物進行篩選[36-37]。具體的篩選數值，滿足OB＞30%，Caco-2＞-0.4 和DL＞0.18則被認為是符合規定的、可通過口服吸收的、具有藥理活性的化合物[36-37]。

1.2 潛在作用靶點反向預測

從SciFinder、TCMSP 數據庫上獲得目標化合物的化學結構，利用Pubchem 數據庫以及其他化學結構數據庫轉換成各活性成分有效成分的SMILES 式，將SMILES式輸入Swiss Target Prediction 數據庫進行靶點預測。Swiss 數據庫是一個在線預測生物活性小分子的大分子靶標（來自人類、小鼠、大鼠的蛋白質）的工具，包含了來自三個不同物種的超過3000種蛋白質的370000 已知活性物質[38-39]。與此同時，由于藥物靶點可能存在命名不規范等問題，本研究使用UniProtKB搜索注釋功能，并且將物種限定為智人，以確保有效的篩選作用于人類的靶點，同時也可以將其校正為蛋白的官方名稱（Official Symbol）以更加精確的為下面的網絡構建和分析做準備，通過以上數據庫的檢索和轉化操作，得到活性成分靶向的蛋白靶點[26]。

1.3 靶點構建的網絡的通路注釋分析

對獲取的蛋白靶點信息，通過DAVID 數據庫進行KEGG 通路注釋分析。將乳香-沒藥藥對靶向的生物網絡靶蛋白（基因）直接注釋到信號通路，藥物靶點富集的通路被認為是藥物調控的信號通路[26,40]。

1.4 乳香-沒藥藥對生物網絡靶點的構建

通過對乳香-沒藥藥對已知靶點的搜集、潛在靶點預測以及富集分析的結果，采用生物信息學可視化軟件Cytoscape 3.4.0 構建活性成分-預測靶點網絡模型和成分-靶點-通路驗證網絡模型[24]。在構建的網絡分析中，活性成分、靶點或者作用通路通過節點（node）來展現等。節點之間則以邊（edge）相連，根據所構建網絡的不同，邊代表的意義也不同[26,41]。

2 結果

2.1 乳香-沒藥藥對有效成分-預測靶點網絡

利用Swiss Target Prediction 所預測的靶點構建“乳香-沒藥藥對有效成分-預測靶點”網絡，該網絡包含271個節點（220個預測靶點和51個有效成分）和769個邊。通過該網絡可發現，一些預測靶點僅被少量有效成分調控，而另一些預測靶點可以被較多的有效成分所調控。例如，雄激素受體（AR）、ESR1（雌激素受體1）、ESR2（雌激素受體2）可被至少15個有效成分所調控，而F2（凝血酶原）、周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）等僅被少部分有效成分調控。有些有效成分共同調控一些靶點，例如，ESR1、ESR2 均可被豆甾醇（Stigmasterol）、二氫黃柏甙（Phellamurin）、矮牽牛苷（Petunidin）、天 竺 葵 素（Pelargonidin）、沒藥醇C（Myrrhanol C）、曼蘇賓-13（17）-烯-3,16-二 酮（Mansumbin-13(17) -en-3, 16-dione）、異氟奎酮（Isofouquierone）、胍甾酮（Guggulsterone）、4,17（20）-（順 式）- 孕 二 烯-3, 16-二酮（4, 17(20) - (cis) -pregnadiene-3,16-dione）、3β-乙酰氧基-16β，20(R)-二羥 基 達 瑪 -24- 烯（3β -acetoxy-16β, 20(R) -dihydroxydammar-24-ene ）、16-hydroperoxymansumbin-13(17)-en-3β-ol、11α-羥基孕甾-4,17（20）-反式二烯-3,16-二酮（11α-hydroxypregna-4,17(20)-transdiene-3,16-dione）、（8R）-3-氧代-8-羥基-多倍體-13E，17E，21-三烯（(8R)-3-oxo-8-hydroxy-polypoda-13E,17E,21-triene）、（20s）-3β，12β，16β，25-五羥基達瑪-23-烯（(20S)-3β,12β,16β,25-pentahydroxydammar-23-ene）、甘遂醇（Tirucallol）所調控（見圖1、表1、表2）。這體現了中藥多組分-多靶點的特性。

圖1 乳香-沒藥藥對有效成分-預測靶點網絡

2.2 乳香-沒藥藥對信號通路-預測靶點-單味藥網絡

通過對預測靶點KEGG 通路富集分析，共返回60條信號通路，其中與治療乳腺增生癥相關的信號通路6 條，通過富集度的高低分別是類固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代謝、血管內皮細胞生長因子（VEGF）信號通路、ErbB 信號通路、mTOR 信號通路、類固醇生物合成。將富集后的信號通路數據構建“乳香-沒藥藥對的單味藥-預測靶點信號通路-網絡”。在該網絡中，乳香調控15個預測靶點，沒藥調控35個預測靶點，提示沒藥在該藥對治療乳腺增生癥的過程中發揮主要作用（見圖2）。在該網絡中，每個信號通路所富集到的預測靶點各有不同（見圖3），反映了有效成分對靶點及信號通路的調節各有側重。信號通路的詳細信息展示于表3。在表3中，信號通路P值代表富集程度，為EASE 評分，是修正的Fisher精確P值，P值越小富集程度越高。

表1 各有效成分調節靶點數目

表2 有效成分調控的預測靶點（前20）

圖2 乳香-沒藥藥對信號通路-預測靶點-單味藥網絡

表3 信號通路詳細信息

圖3 各通路所包含靶點數目

2.3 乳香-沒藥生物過程-預測靶點-單味藥網絡

通過預測靶點的GO富集分析，共返回497個生物過程，其中與治療乳腺增生癥相關的生物過程有14條，通過富集度的高低分別為類固醇代謝過程、對激素刺激的反應、類固醇生物合成過程、對類固醇激素刺激的反應、甾醇代謝過程、調節激素水平、激素代謝過程、對雌激素刺激的反應、雌激素代謝過程、甾醇生物合成過程、對皮質類固醇刺激的反應、類固醇激素受體信號通路、對雌二醇刺激的反應、雌激素生物合成過程。根據所獲得的生物過程數據，構建“乳香-沒藥生物過程-預測靶點-單味藥網絡”，乳香調控60個預測靶點，沒藥調控18個預測靶點，提示沒藥在該藥對治療乳腺增生癥的過程中發揮主要作用（見圖4）。在該網絡中，每個生物過程所富集到的預測靶點各有不同（見圖5），反映了有效成分對生物過程的調節各有側重。生物過程詳細信息展示見表4，提示乳香-沒藥藥對通過其有效成分作用于不同的分子靶點群，進而調控乳腺增生癥相關的生物過程。

3 討論

在乳香-沒藥藥對靶向乳腺增生癥的這些生物過程和信號通路中，網絡分析的結果顯示，生物過程和信號通路都與卵巢功能的失調有關，例如，其中具體的調控靶點如：雄激素受體（AR）、ESR1（雌激素受體1）、ESR2（雌激素受體2）等可被藥對中的至少15個有效成分調控。這顯示了乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥發生發展的病理機制，尤其是作為治療乳腺增生癥中藥復方中的核心藥對發揮作用的具體機制。最近的實驗研究也證實了該結果，Hao 等發現乳香和沒藥可靶向雌激素受體α（ERα），其通過促進ERα和HSP90 的解離，導致ERα的降解和阻斷ERα向細胞核的轉運，以此來阻斷雌激素的作用；乳香和沒藥還通過與HSP90 結合引起ERα和其他癌蛋白的解離[42]。對單一成分的研究也證實，胍甾酮（guggulsterone）對類固醇激素受體具有較高的親和力，并可作用于它們從而發揮相應效果，包括雄激素（AR）、糖皮質激素（GR）和孕酮受體（PGR）、雌激素受體（ESR）[43]。柑桔素（naringenin）聯 合 他 莫 昔 芬 可 以 下 調ERα66 和GPR30的表達，而且上調ERβ和ERα36[44]。

目前，已知正常的乳腺發育中，雌激素和孕激素共同促進乳腺導管，小葉以及腺泡的發育[45-46]。當卵巢功能調節失常時以及下丘腦-性腺軸失常時，雌激素升高，孕激素降低，雌孕比例升高，進而使得乳腺組織增生在一個完整的月經周期內出現病理性的增生，從而導致乳腺導管上皮和周圍纖維組織增生，增生的乳腺末梢和乳管腺泡形成囊腫，出現乳腺增生癥[47-48]。此外，催乳素同樣是導致乳腺增生的重要因素[49]。一方面高水平的催乳素與乳腺上皮細胞表面的催乳素受體結合，改變細胞膜的功能；另一方面，催乳素可進入細胞內于核受體結合從而導致后續的一系列轉錄和合成，增加乳腺腺泡和導管的增生[49]。流行病學的調查結果顯示，乳腺增生癥患者催乳素水平異常增高，通過中西醫結合的綜合管理可以降低催乳素含量，改善治療乳腺增生癥[50]。因此，催乳素水平的增高與乳腺增生也存在密切關系。隨機對照試驗的結果也顯示補充乳香、甜菜堿和肌醇可減少年輕女性纖維腺瘤的大小[51-52]。

圖4 乳香-沒藥藥對治療乳腺增生癥的對應靶點

圖5 各生物過程所包含靶點數目

在乳腺增生癥中雌激素及其介導的信號通路顯示，雌激素通過兩條途徑共同促進乳腺細胞的發育[53]，一方面，E2與ER形成的激素受體復合物促使ER成為獨立的二聚體結構，導致E2 和細胞DNA 的親和力增加，進而促進下游的一系列轉錄和相關蛋白的表達，促進乳腺細胞的增殖[54]；另一方面，E2 與乳腺細胞膜上G 蛋白偶聯受體(GPER)結合，通過第二信使系統激發MAPK 級聯反應并激活ERK/c-fos 途徑，進而促進乳腺細胞的增殖[53-54]。已知PI3K/AKT 信號通路具有促進乳腺細胞增殖、抑制凋亡以及血管生成等功能，其功能通過影響其下游的多種效應分子而實現[55-56]。曼蘇賓酸具有強力消炎作用，約為傳統非甾體類藥物吲哚美辛（消炎痛）的50 倍[57]。通過對乳香-沒藥藥對的靶點的信號通路富集顯示：類固醇激素生物合成，雄激素和雌激素代謝，VEGF 信號通路，ErbB 信號通路，mTOR 信號通路，類固醇生物合成，這些都顯示了乳香-沒藥藥對通過調控乳腺細胞增殖、炎性反應、血管生成、細胞凋亡和自噬等信號傳導通路發揮抑制乳腺增生的作用。目前，實驗研究顯示，主要活性成分來自乳香沒藥的西黃丸能調節激素及受體表達水平，增強抗氧化能力和免疫功能，改善增生病理組織，具有抗乳腺增生作用[58-60]。基于實驗研究可推測，乳香-沒藥藥對中的有效成分成分胍甾酮（guggulsterone）、柑桔素（naringenin）等可能通過調節類固醇激素受體（ESR、PGR、AR、GR）及其他靶點，進而調控類固醇相關信號通路和生物過程（mTOR 信號通路、類固醇生物合成、對雌激素刺激的反應、雌激素代謝過程、甾醇生物合成過程、對皮質類固醇刺激的反應）及其他生物過程，從而發揮抑制乳腺增生的作用[42-44]。

表4 生物過程詳細信息

綜上所述，乳香-沒藥藥對抑制乳腺增生的活性成分主要有甘遂醇、扁枝杉烯、乳香脂酸、因香酚、α-乳香酸、乙酰-α-乳香酸、β欖香酮酸、沒藥甾酮、沒藥甾醇VI、沒藥甾醇IV、沒藥醇C、3-甲氧基呋喃-9-烯、2-甲氧基呋喃-9-烯-8-酮、16S,20R-二羥基達瑪-24-烯-3-酮、豆甾醇、槲皮素、曼蘇賓酸、曼蘇賓13-17-烯-3,16 二酮、15α-羥基曼蘇賓酮、異氟奎酮、淫羊藿醇、木脂素、菠菜甾醇、卡巴拉酮、卡巴雌二醇乙酸酯、β-谷甾醇、7β，15β-二羥基孕甾-4-烯-3,16-二酮、4,17（20）-順式-孕二烯-3,16-二酮等51個；涉及作用靶點271個，其中前20個分別是：雄激素受體、細胞色素P45019A1、微管相關tau 蛋白、雌激素受體α、雌激素受體β、鈉依賴性去甲腎上腺素轉運蛋白、類固醇17α-羥化酶/17,20 裂解酶、糖皮質激素受體、鹽皮質激素受體、鈉依賴性多巴胺轉運蛋白、鈉依賴性血清素轉運體、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體2 型、1 型酪氨酸蛋白磷酸酶非受體、酪氨酸DNA 磷酸二酯酶1、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶、鈉和氯依賴性甘氨酸轉運體1、鈉和氯依賴性甘氨酸轉運體2、皮質類固醇11β脫氫酶同工酶1、大麻素受體1、羥類固醇11β脫氫酶1樣蛋白。這些靶點在乳腺增生調控中主要涉及類固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代謝、VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、mTOR 信號通路、類固醇生物合成等六條信號傳導通路，和類固醇代謝過程、對激素刺激的反應、類固醇生物合成過程、對類固醇激素刺激的反應、甾醇代謝過程、調節激素水平、激素代謝過程、對雌激素刺激的反應、雌激素代謝過程、甾醇生物合成過程、對皮質類固醇刺激的反應、類固醇激素受體信號通路、對雌二醇刺激的反應、雌激素生物合成等14條生物過程，其作用機制主要體現在抑制乳腺細胞增生、促進細胞凋亡自噬、抑制炎癥反應和血管新生等方面。

大數據時代的到來，為中醫藥的研究提供了十分強大的方法學，對中醫藥現代化發展具有重要意義。中藥作為中醫臨床實踐的載體是中醫學科發展的不可或缺的組成部分，盡管中藥療效已為幾千年的歷史和現代醫療實踐所肯定，但明確中藥科學內涵仍然是中醫藥發展的要求。現代化的中醫藥研究最初通過辯證用藥等文本和文獻的數據挖掘揭示臨床用藥治療的一般規律，再從臨床出發，通過應用現代化學、現代生物學方法提取分析發現有效成分，到如今大數據和人工智能進行進行海量資料分析整合，為闡明中藥的作用機理、發現新的治療藥物、豐富中藥理論提供了切實可行的實現路徑。

本文通過對乳香-沒藥藥對現代藥理學的文獻調研和利用計算機軟件進行預測，利用cytoscape 3.4.0軟件對傳統理論與現代藥理學關聯性網絡，化學成分-潛在靶點網絡，單味藥-潛在靶點-信號通路網絡進行分析。再從整體、組織、細胞、分子四個水平對該藥對的化學成分、作用靶點、作用通路三個方面所所篩選的多組分、多指標數據進行網絡構建和分析，初步闡明了乳香-沒藥藥對作用乳腺增生癥的物質基礎和作用機理。雖然通過網絡藥理學方法已經可以全面系統地展示乳香-沒藥藥對中潛在活性成分的抗乳腺增生癥的效果，但是這種方法不能直接反映化合物含量對預測靶點、信號通路和生物過程的影響等，這也是目前網絡藥理學方法的局限性。然而，這并不能否認網絡藥理學的重要意義，未來的研究可根據網絡藥理學預測結果針對性地對部分靶點、信號通路、生物過程等進行研究，從而節省時間和精力，有利于進行更加深入、系統地研究。

4 結論

本研究通過運用DL 評估、OB 預測、Caco-2 通透性的方法，獲得了可能是乳香-沒藥藥對的可口服吸收的和具有藥理活性的成分，預測了潛在的作用靶點和乳腺增生癥相關信號通路和生物過程，初步闡明了乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥的物質基礎和作用機理。

4.1 乳香-沒藥藥對抑制乳腺增生的主要活性成分

本研究初步明確了乳香-沒藥藥對抑制乳腺增生的51個主要活性成分：甘遂醇、扁枝杉烯、乳香脂酸、因香酚、α-乳香酸、乙酰-α-乳香酸、β欖香酮酸、沒藥甾酮、沒藥甾醇VI、沒藥甾醇IV、沒藥醇C、3-甲氧基呋喃-9-烯、2-甲氧基呋喃-9-烯-8-酮、16S,20R-二羥基達瑪-24-烯-3-酮、豆甾醇、槲皮素、曼蘇賓酸、曼蘇賓13-17-烯-3,16 二酮、15α-羥基曼蘇賓酮、異氟奎酮、淫羊藿醇、木脂素、菠菜甾醇、卡巴拉酮、卡巴雌二醇乙酸酯、β-谷甾醇、7β，15β-二羥基孕甾-4-烯-3,16-二酮、4，17（20）-順式-孕二烯-3，16-二酮等。

4.2 乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥的作用靶點

本研究初步明確了乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥的271個作用靶點，其中前20個分別是：雄激素受體、細胞色素P45019A1、微管相關tau 蛋白、雌激素受體α、雌激素受體β、鈉依賴性去甲腎上腺素轉運蛋白、類固醇17α-羥化酶/17,20 裂解酶、糖皮質激素受體、鹽皮質激素受體、鈉依賴性多巴胺轉運蛋白、鈉依賴性血清素轉運體、酪氨酸蛋白磷酸酶非受體2 型、1 型酪氨酸蛋白磷酸酶非受體、酪氨酸DNA磷酸二酯酶1、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶、鈉和氯依賴性甘氨酸轉運體1、鈉和氯依賴性甘氨酸轉運體2、皮質類固醇11β脫氫酶同工酶1、大麻素受體1、羥類固醇11β脫氫酶1樣蛋白。

4.3 乳香-沒藥藥對調控乳腺增生癥的信號傳導通路

本研究初步明確了乳香-沒藥藥對調控乳腺增生癥的6條信號傳導通路：類固醇激素生物合成、雄激素和雌激素代謝、VEGF 信號通路、ErbB 信號通路、mTOR信號通路、類固醇生物合成。

4.4 乳香-沒藥藥對調控乳腺增生癥的生物過程

本研究初步明確了乳香-沒藥藥對調控乳腺增生癥的14個生物過程：類固醇代謝過程、對激素刺激的反應、類固醇生物合成過程、對類固醇激素刺激的反應、甾醇代謝過程、調節激素水平、激素代謝過程、對雌激素刺激的反應、雌激素代謝過程、甾醇生物合成過程、對皮質類固醇刺激的反應、類固醇激素受體信號通路、對雌二醇刺激的反應、雌激素生物合成。

4.5 乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥的作用機制

本研究初步闡明了乳香-沒藥藥對干預乳腺增生癥的作用機制主要體現在抑制乳腺細胞增生、促進細胞凋亡自噬、抑制炎癥反應和血管新生等方面。