屏南龍源‘四季杜鵑’古樹組培快繁技術研究

胡計紅 陳桂信 楊惠婷 康建坂 甘代奎

摘 ?要：以屏南縣棠口鄉龍源村400多年‘四季杜鵑古樹的頂芽為外植體，開展離體快繁技術研究，探討外植體消毒方式、取材時間對無菌系建立的影響，培養基中植物生長調節劑種類和配比對芽苗繼代增殖的影響，以及培養基中植物生長調節劑的種類與配比對無根苗瓶內生根的影響。試驗結果表明，外植體表面消毒以75%酒精作用30 s后再用0.1% HgCl2消毒8 min，消毒效果最好。外植體最佳的取材時間為5月中旬前后。在無菌系建立中污染的外植體可采用75%酒精消毒20 s，然后用0.1% HgCl2消毒5 min，再經4次轉瓶后成功率可達71%。初代培養的最適培養基為WPM+3.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3 ，平均有效芽數為3.45。在增殖培養中，帶腋芽莖段誘導叢生芽的增殖效果優于頂芽，最適培養基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，增殖系數達13.23。最適的瓶內生根培養基為：WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA，生根率達92.6%。本研究的結果可為‘四季杜鵑古樹的保護與開發利用提供理論與技術支持。

關鍵詞：屏南四季杜鵑;古樹;離體快繁

中圖分類號：Q813.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Rapid propagation in vitro was explored using the apical buds of an ancient Four-season Rhododendron tree， more than 400 years， from Longyuan Village， Tangkou Town， Pingnan County as the explants to find the effects of sterilizing methods and time of explants on the development of sterile cultures， effects of kinds and ratios of plant growth regulators added in the media on the proliferation of shoots and rooting of rootless shoots. The optimum sterilization conditions were the explants treated with 75% of ethanol for 30 seconds and then dipped with 0.1% of HgCl2 for 8 minutes. The optimum sampling period for explants was about middle to late May. After four times of bottle transfer success rate of re-sterilizing reached 71% through rescuing of the contaminated explants in the development of sterile cultures by treating with 75% of ethanol for 20 seconds and then dipping with 0.1% of HgCl2 for 5 minutes. The optimum components of the medium in the primary culture was WPM medium added 3.0 mg/L of zeatin （ZT）， 0.1 mg/L of NAA and 0.5 mg/L of GA3， on which the average number of induced valid buds was 3.45. In the proliferation culture， the clustered shoots were induced from apical and stem segments with axillary buds of sterile plant-lets inoculated on Anderson medium added 0.5 mg/L of TDZ and 0.1 mg/L of NAA， multiplication coefficient of stem segments with axillary buds was higher than that of apical buds， reached 13.23. In the rooting culture of rootless shoots， the optimum medium was WPM medium added 0.1 mg/L of ZT and 0.5 mg/L of NAA， on which the rooting rate reached 92.6%. The results would provide theoretical and technical supports for conservation， exploitation and utilization of the ancient Four-season Rhododendron tree.

Keywords： Pingnan Four-season Rhododendron; ancient tree; rapid propagation in vitro

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.017

杜鵑花是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）著名觀賞植物[1]。福建‘四季杜鵑觀賞價值很高，但大多處于山間野生狀態，很少人工栽培，甚至有些稀有類型僅單株保存延續種性。屏南縣地處閩東的寧德市高海拔山區，分布著豐富多樣的‘四季杜鵑種質資源，在棠口鄉龍源村村口有1株開紅花的杜鵑花古樹，經鑒定該樹屬錦繡杜鵑（Rhododendron pulchrum Sweet）變種，樹齡400 a以上，該樹四季開花，成為屏南縣獨有的、有開發利用價值的珍稀地方種質資源。

屏南縣龍源村的‘四季杜鵑古樹具有一般高山杜鵑特性：枝粗葉少、無種子、生長周期長、通常靠扦插繁殖[2]。但隨著樹木的成熟，插穗形成不定根的能力逐漸下降[3]，且古樹生理年齡大，芽的分生能力弱，扦插成活率低，對母樹的傷害和受繁殖季節影響大，很難實現對古樹的保護利用。組培快繁具有所需繁殖材料少、繁殖系數高、種苗基因型和長勢整齊一致、不受季節影響等優點[4]，被廣泛應用于杜鵑花的繁殖與工廠化生產。1975年Anderosn[5]以高山杜鵑的莖尖為外植體，進行組織培養研究，成功獲得再生植株;在此基礎上，湯桂鈞等[6]探討了基本培養基種類對高山杜鵑繼代增殖的影響;王吉等[7]、劉玉東等[8]篩選了高山杜鵑繼代增殖培養基中植物生長調節劑種類和濃度配比的最佳組合。

‘四季杜鵑古樹樹齡長，生命力和再生能力較弱，植株表面和體內寄生了多種病原菌（圖1C），給組培快繁增加了難度;20世紀80年代初期，屏南縣政府邀請了中科院上海植生所的研究人員，曾對該杜鵑花古樹進行組培快繁試驗，未獲得成功;1986年，福建農學院陳振光等[9]對傳統杜鵑組培技術進行改進，在MS基本培養基中，添加高強度的細胞分裂素6-（Hydroxy-3-methy?lbut-2-enylamino）purin （ZT）和6-（γ，γ-Dimethylall?ylamino）purine （2iP）和1-Naphthylacetic acid （NAA），成功誘導再生植株，并移栽成活，組培苗成年后，表現花期長，除了盛夏不開花，其余時間鮮花不斷;該研究未公布培養基的植物生長調節劑的配比，無法給后續的研究提供借鑒。

本研究以屏南縣的‘四季杜鵑古樹的頂芽為材料，參考前人的杜鵑組培快繁技術，改進無菌系建立的方法，減少污染率，提高成活率;優化初代培養、繼代增殖和生根培養的基本培養基種類和植物生長調節劑的種類與配比，建立‘四季杜鵑古樹的組培快繁體系，為今后‘四季杜鵑古樹的保護、繁育和開發利用提供理論與技術支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

莖段外植體分別于2018年10月中旬、2019年3（圖1A）、5（圖1B）、6月份中旬采自福建省寧德市屏南縣棠口鄉龍源村的‘四季杜鵑古樹當年生中上部新枝。

1.2 ?方法

1.2.1 ?無菌系建立 ?對10月中旬取材的龍源‘四季杜鵑古樹單芽嫩枝進行消毒處理。除去葉片，留有葉柄的帶頂芽莖段在流水下用軟毛刷輕輕刷洗表面，5% 雕牌洗衣粉溶液洗滌浸泡25 min，蒸餾水沖洗20 min，50 %多菌靈浸泡30 min，蒸餾水沖洗3次，然后轉至超凈工作臺，無菌水沖洗3次，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，然后采用0.1% HgCl2做不同的消毒時間處理，最后用無菌水洗5次以上;用濾紙吸干材料表面水分，將材料剪成帶頂芽莖段，接入WPM+蔗糖30 g/L+瓊脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4培養基中。10 d后，統計其污染數，30 d后觀察外植體生長情況，對污染率、死亡率、成活率進行統計。次年3、5、6月份中旬取材的‘四季杜鵑古樹嫩枝做同上處理，0.1% HgCl2消毒采用8 min。培養條件均為：溫度（25±2） ℃，光照強度1500～2000 Lux，光照時間12 h/d。

1.2.2 ?無菌系建立中污染的外植體再消毒利用 ?將污染的外植體取出，用軟毛刷清洗、蒸餾水沖刷后，分別以5個消毒處理（酒精30 s、次氯酸鈉15 min、酒精20 s+次氯酸鈉5 min、酒精20 s+ HgCl2 5 min、酒精30 s+ HgCl2 5 min）進行滅菌。后接入WPM培養基中，每個處理15瓶，3次重復;接種10 d后觀察污染情況，30 d后觀察外植體生長情況進行數據統計。

1.2.3 ?誘導培養 ?將未污染且成活的外植體，接種于以WPM和1/4MS為基本培養基添加了（3.0、5.0） mg/L ZT和0.1 mg/L NAA組合的初代培養基上，誘導腋芽萌發。每個處理接種15瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復;接種后40 d統計高度大于2 cm的有效芽誘導數（1/4 MS培養基中附加蔗糖30 g/L，瓊脂6.7 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.4 ?繼代增殖培養 ?將經誘導培養的無菌苗頂芽與帶腋芽莖段分別接種于以WPM和Anderson為基本培養基并附加（0.5、1.0）mg/L ZT和0.1 mg/L NAA或（0.5、1.0） mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA組合的不同增殖培養基中，每個處理接種5瓶，每瓶接種3個外植體，3次重復;接種后60 d統計分析，篩選出杜鵑增殖培養過程中最佳培養基組合（Anderson培養基中附加蔗糖30 g/L，瓊脂7.2 g/L，pH 5.0～5.4）。

1.2.5 ?瓶內生根培養 ?選取增殖培養后長勢一致的無根苗，剪成長2～3 cm左右的帶頂芽莖段，分別接種于添加了（0.5、1.0）mg/L NAA或（0.5、1.0）mg/L IBA或0.1mg/L ZT與（0.5、1.0）mg/L NAA組合的WPM生根培養基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種2個外植體，3次重復;接種后60 d觀察統計無根苗的生根情況計算生根率。

1.3 ?數據處理

采用Excel整理實驗數據，SPSS 22.0進行差異顯著性分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?HgCl2消毒時間對無菌系建立的影響

10月初取材，不同時間消毒處理結果不同。如表1所示，隨著HgCl2消毒時間的增加，3號處理與各處理相互間平均污染率具有顯著性差異，但5號處理平均污染率最低，為31.3%;平均死亡率在1和3號處理上無顯著性差異，其他處理間差異性顯著;1號處理平均死亡率最低，為14.9;平均成功率在1和2號處理間差異不顯著，4號處理平均成功率顯著高于其他處理，為44.3%，5號處理平均污染率雖然最低，但消毒時間較長，0.1% HgCl2對頂芽產生毒害，成功率低。所以，‘四季杜鵑古樹當選用頂芽作為外植體時，0.1% HgCl2最佳的表面消毒時間為8 min。

2.2 ?取材時間對無菌系建立的影響

10月初與3、5、6月份中旬分別采‘四季杜鵑古樹帶頂芽的莖段，如表2所示，經消毒處理后，不同月份取材對無菌體系建立階段平均污染率、平均死亡率、平均成功率均存在顯著性差異（P<0.05）;3號處理，平均污染率和死亡率最低，分別是22.5%和10.8%，平均成功率最高，為66.7%;所以，5月中旬為外植體最佳取材時間。

2.3 ?污染的外植體再消毒對無菌系建立的影響

對無菌系建立階段外植體僅基部長菌污染的，進行再消毒和4次轉瓶處理。如表3所示，消毒方式不同平均污染率在1、3與2、4、5號處理間具有顯著性差異，1號處理最高，達79.5%;平均死亡率均具有顯著性差異，其中 2號處理死亡率較高，為84.8%;1、2、3號處理的成功率為0，4號處理平均成功率達到71%，且與其他處理差異性顯著。因此，酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min為外植體污染再消毒的最佳方式。

2.4 ?基本培養基種類與植物生長調節劑配比對初代培養的影響

在誘導不定芽的過程中，接種的外植體整體在第7～10 d不定芽萌發（圖2A），20 d后不定芽伸長，生長速度較快（圖2B），30 d后不定芽伸長至2.0～2.5 cm，葉片下垂（圖2C），第40 后不定芽生長速度緩慢（圖2D）。如表4所示：3號處理誘導的平均有效芽數最多，為3.45，且生長狀況相對較好;1/4 MS為基本培養基時，平均芽數為3.36，與WPM培養基中芽數相近，但1/4 MS誘導的不定芽細長卷曲狀，狀態差;綜合以上，在初代培養中，‘四季杜鵑古樹最佳培養基為：WPM+3.0 g/L ZT+0.1 mg/L NAA。

2.5 ?基本培養基與植物生長調節劑對無菌苗頂芽繼代增殖的影響

在無菌苗頂芽誘導不定芽過程中，添加ZT培養基組合7～10 d頂芽伸長不定芽萌發，30 d不定芽伸長至2 cm左右，60 d后生長緩慢，葉片逐漸下垂變褐，均無愈傷組織形成;在添加TDZ培養基組合中，7～10 d不定芽萌發，基部有愈傷組織形成，30 d不定芽長勢良好，基部愈傷組織不定芽萌發（圖3A）;60 d（圖3B）不定芽伸長至1.0～2.5 cm，生長緩慢;如表5，在WPM培養基中添加ZT或TDZ時，隨著ZT或TDZ濃度的提高，平均芽誘導率差異不明顯或無差異（P< 0.05），芽的增殖系數隨著其濃度的提高均達到顯著性差異;在Anderson培養基中，隨著ZT濃度的提高，平均芽誘導率和增殖系數隨著其濃度的提高均達到顯著性差異，隨著TDZ濃度的提高，平均芽誘導率無差異，芽的增殖系數隨著其濃度的提高達到顯著性差異;7號處理的芽誘導率100%，芽增殖系數為9.31，顯著高于其他培養基組合;因此，頂芽誘導不定芽的最適培養基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.6 ?基本培養基與植物生長調節劑對無菌苗帶腋芽莖段繼代增殖的影響

帶腋芽莖段在添加ZT的培養基組合中無愈傷組織形成，7～10 d不定芽從基部或葉腋處萌發，30 d后不定芽增殖狀態穩定，60 d后不定芽生長緩慢，均高2.5 cm左右;在添加TDZ的培養基組合中，10～20 d莖段基部或葉腋處不定芽萌發，基部有愈傷組織形成，30 d不定芽伸長0.1～0.5 cm左右，愈傷組織上不定芽萌發（圖3C），60 d后不定芽呈簇生狀，生長緩慢（圖3D）;如表6，在WPM培養基中添加ZT或TDZ時，隨著ZT或TDZ濃度的提高，平均芽誘導率均為100%，無顯著差異（P<0.05），芽的增殖系數隨著其濃度的提高均達到顯著性差異;在Anderson培養基中，隨著ZT濃度的提高，平均芽誘導率和增殖系數隨著其濃度的提高均達到顯著性差異，隨著TDZ濃度的提高，平均芽誘導率無差異，芽的增殖系數隨著其濃度的提高達到顯著性差異;7號的增殖系數最高，為13.23;因此，帶腋芽莖段誘導不定芽的最佳培養基組合為Anderson+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.7 ?植物生長調節劑種類與配比對無根苗瓶內生根的影響

觀察發現，在添加了生長素NAA或IBA的培養基中，60 d后不定根萌發，90 d后不定根伸長，在添加IBA的培養基中生根率較低;在僅添加了NAA的培養基中生根率較好但根系易形成棉絮狀斷根（圖4A）;添加0.1 mg/L ZT和0.5 mg/L NAA的培養基中，第30天基部形成愈傷組織，不定根萌發，60 d后不定根伸長（圖4B、圖4C）。如表7所示，在添加了不同植物生長調節劑的WPM培養基中;生根率隨著生長調節劑的種類與濃度變化，均存在顯著差異，平均根長僅5號處理存在差異，其他無顯著差異，平均生根數2號與6號處理無顯著差異，其他組合存在顯著差異;5號處理中生根率、平均根長、平均生根數顯著高于其他組合，未添加植物生長調節劑的對照組，生根率為0;因此，生根培養基最佳組合為WPM+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA。

3 ?討論

污染問題一直是影響植物組織培養是否成功的關鍵因素之一[10]，前人研究表明，高山杜鵑組織培養以HgCl2為主要表面消毒劑時，外植體處理5～10 min作用效果較好[6-7， 11-12]。本研究得出10月份取材，對龍源‘四季杜鵑古樹HgCl2處理，成功率隨著消毒時間增加先上升后下降，以消毒8 min效果最好，成功率為44.6%;為優化無菌系建立的成功率，對材料進行不同時間取材對比，10月份取材時，外植體生理較老化，消毒和不定芽誘導困難，成功率較低;3月份取材，當年新生枝條較短，幾乎只能采集到1 cm左右長的莖尖，外植體消毒困難，成功率低;6月份為梅雨季節，連續的陰雨天容易滋生細菌，導致外植體的污染率更高;龍源‘四季杜鵑的生長旺盛期在5月份。試驗結果表明，5月中旬的晴天取幼嫩的頂芽，成功率最高，達到66.7%，這與鐘宇等[4]研究結果相似，在3—5月植物處于生長旺盛期，接種成功率較高。國內外近些年以葉片或花蕾作為外植體建立杜鵑組培快繁技術體系也較多[13-16]，Tomsone等[17]也在對常綠杜鵑‘伊琳娜的研究中指出，花蕾芽作為外植體更容易控制污染。龍源‘四季杜鵑已有400年以上樹齡，樹體表面及內生菌嚴重，其生存環境差、生理年齡較高、生命活性弱等都給無菌系建立帶來了阻礙，可嘗試以葉片或花蕾為外植體建立無菌系，是否能夠提高成功率還有待試驗。

‘四季杜鵑古樹的取材有限，生長環境差，枝條攜帶病原菌和內生菌嚴重，在無菌系建立中，通過表面消毒，可去除外植體表面的病原菌，但無法去除體內的內生菌，內生菌主要通過維管束運輸到培養基中，引起外植體的再次污染。因此，將污染的外植體重新消毒轉瓶再培養，可提高接種材料的利用率和成活率，節約外植體。唐映紅等[18]在無菌系建立階段將外植體經過反復轉瓶的方法消除莖段中的內生菌，得到無菌幼芽;參考前人經驗，本研究將污染的外植體進行再1次消毒處理，幫助消除外植體表面的寄生菌，再經過4次轉瓶，減少外植體切口處分泌的內生菌（此方法還沒有文章提到過）;通過不同消毒方式對比，以酒精20 s+0.1% HgCl2 5 min處理和4次轉瓶后，成功率達到71%，有效挽救了污染的外植體，提高外植體的利用率。

培養基種類及植物生長調節劑對組培苗生長發育有顯著影響。初代培養在1/4 MS培養基中的杜鵑葉片出現卷曲，在WPM培養基中杜鵑長勢較好。增殖培養中，在植物生長調節劑共同作用下，WPM培養基中的杜鵑部分容易出現玻璃化現象，Anderson培養基中杜鵑長勢較好;1/4 MS和WPM對杜鵑枝條培養的不適宜性可能與培養基中礦質營養素的濃度有關，杜鵑花科植物適宜生長在低pH和低營養狀況的土壤中[19]，表明用于這類植物組織培養的培養基應為低離子濃度[20]，在Anderson培養基上表現較好的生長狀況可能由于其離子濃度較低，適宜‘四季杜鵑古樹的生長。此外，增殖培養階段帶腋芽莖段比頂芽更適宜增殖培養，無論培養基或植物生長調節劑如何腋芽的增殖系數都比頂芽高，這在誘導迷人杜鵑和迎紅杜鵑從生芽上也得到同樣的結果[21-22]。

由于‘四季杜鵑古樹生理年齡大，對低強度的細胞分裂素反應遲鈍，因此，在本研究中使用了高強度的細胞分裂素（ZT和TDZ）。試驗結果表明，不同強度的細胞分裂素對‘四季杜鵑古樹繼代增殖效果上存在明顯差異，由于TDZ的強度高于ZT，TDZ和NAA濃度及其相互作用顯著影響愈傷組織和芽的形成，其愈傷誘導率比ZT與NAA組合的培養基高，添加0.5 mg/L TDZ的培養基，增殖系數達到13.23，是ZT培養基組合的2倍;但是在不定芽誘導的質量上，TDZ組合的培養基上誘導的無菌苗，多數呈簇生狀，細弱矮小;雖然TDZ能快速有效地誘導外植體產生不定芽或叢生芽，但抑制了不定芽的伸長[12， 17]，影響無菌苗的質量;因此，在TDZ組合培養基中誘導的不定芽，必須轉接到不含TDZ的培養基中進行壯苗培養，提高無菌苗質量;而ZT組合培養基誘導的不定芽或叢生芽生長正常，無菌苗長勢較好，無須進行壯苗培養，該結果與郭穎等[23]和Preece等[24]在杜鵑組培快繁上的研究結果相一致。

在一般組培快繁的生根培養中，通常使用低大量元素的基本培養基，去除培養基中的細胞分裂素，只加入生長素，Wei等[25]在云錦杜鵑的生根培養中，基本培養基為WPM，只添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率達84.0%;而在‘四季杜鵑古樹的生根培養中，雖然在WPM基本培養基中添加了1.0 mg/L的IBA，其生根率很低，僅為11.8%，NAA的生根效果顯著高于IBA，這與王育選等[26]的試驗結果一致;本研究中，在生根培養基中添加低濃度的ZT，能有效刺激無菌苗的生根，生根率顯著提高，這可能與‘四季杜鵑古樹的生理年齡有關，生理年齡大，對生長素的反應遲鈍，需要細胞分裂素的刺激來啟動根原基的細胞分裂，‘四季杜鵑古樹的最佳的生根培養基為WPM+0.1 mg/ LZT+0.5 mg/L NAA，其無根苗的生根率達92.6%。

裴東等[3]指出，組織培養技術為樹木的復幼提供了一個良好的實驗體系，試驗誘導產生的不定芽使形成的植株表現出一定程度復幼，且連續多次繼代培養可使許多成熟樹木的分生組織復幼;本研究對‘四季杜鵑古樹組培快繁體系的建立，幫助古樹恢復其幼態特征，如提高生根能力等;前期的實驗研究也為后面移栽打下基礎，這對古樹保護利用具有重要意義。

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