轉α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

陳教云 KHANQaisar 韋江璐 唐麗華 董登峰 李楊瑞

摘 ?要：本研究對已獲得的轉α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗株系進行PCR擴增及測序，從檢測陽性的轉基因甘蔗中選6個轉基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）與非轉基因野生型甘蔗對照（WT）進行了低溫脅迫（4 ℃）處理，在處理0、5、10 d測定甘蔗葉片丙二醛（MDA）和滲透調節物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并采用RT-qPCR法分析了低溫處理下甘蔗葉片α-微管蛋白基因的表達情況。結果表明：在4 ℃低溫處理下，6個轉SoTUA基因甘蔗與WT中α-微管蛋白的轉錄因子表達量隨著脅迫時間的延長上調表達。脅迫后5、10 d轉基因株系的相對表達量始終高于WT甘蔗，低溫處理10 d時轉基因T1顯著高于其他株系（P<0.05）。在低溫脅迫下，甘蔗的MDA含量逐漸增高，而轉基因甘蔗增幅顯著低于WT甘蔗，10 d時轉基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之間變化趨勢不同，但轉基因甘蔗POD活性顯著高于WT甘蔗（P< 0.05）;轉基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性隨著脅迫天數增加呈現先增加后減少的趨勢，而WT與轉基因T3、T5的SOD活性逐漸升高;甘蔗的可溶性糖含量逐漸上升，轉基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d顯著高于野生型甘蔗，脅迫后變化趨勢在株系之間有所差異;轉基因甘蔗SoTUA相對表達量與可溶性糖含量呈極顯著的正相關。利用隸屬函數綜合分析評價，抗寒性排序結果為：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低溫脅迫下，轉基因甘蔗SoTUA基因的上調表達能提高甘蔗的抗寒性，且具有遺傳穩定性。

關鍵詞：甘蔗;SoTUA基因;抗寒性;生理生化;遺傳穩定性

中圖分類號：S556.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Six SoTUA transgenic lines （T1， T2， T3， T4， T5， T6） were selected from the positive SoTUA transgenic sugarcane lines of T2 generation after PCR amplification and sequencing. The transgenic lines and control （wild type， WT） were treated with low temperature stress （4 ℃）， and the level of malondialdehyde （MDA） and osmotic adjustment substances （soluble sugar， soluble protein） and activities of peroxidase （POD） and superoxide dismutase SOD was were determined， and RT-qPCR analysis was done for SoTUA gene expression in sugarcane leaves at 0， 5 and 10 days of the treatment. The relative expression of α-tubulin transcription factor in the SoTUA transgenic sugarcane and WT was up-regulated， getting higher with the cold stress time under low temperature treatment at 4 ℃. The relative expression level was always higher in the SoTUA transgenic lines than that in WT at 5 and 10 days of the treatment. At the 10th day， the relative expression level of the transgenic line T1 was significantly higher than that of other transgenic strains （P<0.05）. The content of MDA increased gradually under cold stress， but it was found significantly lower in the transgenic sugarcane than that in WT by 41.77% （P<0.05）. The trend of POD activity varied among different lines， but it was higher in the SoTUA transgenic lines than in WT （P<0.05）. The SOD activity of transgenic lines T1， T2， T4 and T6 increased first and then decreased while SOD activity of WT and transgenic lines T3 and T5 increased gradually. The soluble sugar content increased gradually and the trend of soluble protein varied in different strains. The expression of SoTUA gene was positively correlated with soluble sugar. Using the membership function comprehensive analysis statistic method， the ranking result for cold resistance was obtained as T3 > T2 > T1 > T5 > T6 > T4 > WT. Up-regulated expression of SoTUA gene in the transgenic sugarcane could improve cold resistance， and the genetic stability is good.

Keywords： sugarcane; SoTUA gene; cold resistance; physio-biochemical characteristic; genetic stability

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.008

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是熱帶、亞熱帶作物，是最重要的糖料作物[1]。低溫寒潮導致甘蔗生產和制糖工業發展受阻，經濟受損[2-3]。培育甘蔗抗寒性品種是減緩低溫損傷的重要途徑，其研究倍受關注，然而傳統的甘蔗育種方法周期長，無法滿足經濟快速發展的需求[4]。隨著基因工程技術的不斷成熟，各種優良的基因不斷被發現和利用，為甘蔗抗寒育種提供了有效的途徑[5]。

微管是細胞骨架的重要成分，植物微管由微管蛋白構建而成，包括α、β和γ 共3個亞基[6]。微管蛋白是信號轉導和物質運輸的通道，干擾微管的形成會影響與凋亡相關的信號通路轉導，從而引起細胞凋亡[7]。近年來，關于微管與植物抗寒關系的研究受到高度重視。研究發現，溫度是影響微管聚合狀態的最敏感因素之一[8]。植物微管在低溫脅迫下迅速解聚，通過調控微管蛋白改變其生理機能抵御低溫[9]。Nyporko等[10]將嗜冷藻類Chloromonas綠單胞菌的α-微管蛋白268位氨基酸殘基插入牛筋草微管蛋白序列中，使得該蛋白表面與綠單胞菌蛋白表面結構相似，結果發現，α-微管蛋白分子表面局部疏水性發生改變，認為其位點可提高植物的抗寒性。Schwarzerová等[11]研究表明，低溫下煙草中細胞核內微管蛋白逐漸積累，復溫后核內微管蛋白消失，核外微管蛋白重建。Bokros等[12]認為，微管蛋白的極端羧基末端是植物微管蛋白調節結構域的關鍵元件，低溫下可調節植物微管穩定性。Paul等[13]從常綠樹茶中克隆α-微管蛋白基因CsTUA發現，低溫下α-微管蛋白表達上調，對維持細胞骨架穩定性起重要的作用。低溫脅迫下，在黃瓜根尖細胞中不同部位的微管穩定性有所差異，且不抗寒品種冷穩定性明顯低于抗寒品種，同時抗寒鍛煉后微管蛋白的含量有所增加[14]。

隨著TUA基因陸續報道，本課題組張保青[15]首次從甘蔗品種GT28葉片中克隆得到甘蔗α-微管蛋白基因SoTUA，對磷酸化位點分析發現，在低溫下其位點能調節微管蛋白的穩定性。孫波[16]運用農桿菌介導法將SoTUA基因成功導入煙草品種K346和甘蔗品種ROC22中，通過PCR檢測獲得了T0代植株。唐麗華等[17]得到轉α-微管蛋白基因SoTUA植株，低溫脅迫下，轉基因的植株的可溶性蛋白、可溶性糖的含量顯著高于對照，MDA含量顯著低于對照。本研究已獲得的轉SoTUA基因T2甘蔗株系需鑒定是否仍保持陽性，并需鑒定其遺傳穩定性。因此對轉SoTUA基因的甘蔗T2代株系進行低溫處理，測定其生理生化特性，并檢測SoTUA基因的表達，篩選出具有良好性狀的轉基因甘蔗株系，為轉基因分子育種奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為轉α-微管蛋白基因SoTUA的T2代甘蔗（ROC22）6個株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）和非轉基因甘蔗對照（WT）。

1.2 ?方法

試驗于2018年在廣西大學甘蔗研究所溫室進行。選擇無病害蔗莖切成單芽莖，用1%多菌靈滅菌30 min后放進沙盤進行沙培，待甘蔗長出2～3葉時，選取長勢一致的甘蔗苗移栽桶中，每桶2株，每株系5桶。待甘蔗長至6～7葉時，放置于人工氣候室[光照強度250～300 μmol/（m2·s）]，14 h光周期，相對濕度為60%～70%進行4 ℃低溫處理，在處理0、5、10 d等3個時間點測定甘蔗+1葉各項生理生化指標和SoTUA基因表達量。

1.3 ?轉基因甘蔗植株鑒定

1.3.1 ?甘蔗DNA提取 ?甘蔗移栽成活后，采集甘蔗+1葉，利用改進的SDS法提取甘蔗葉片總DNA[18]，用1%瓊脂凝膠電泳檢測DNA質量。

1.3.2 ?PCR檢測 ?根據pCAMBIA3300載體[16]上的標記基因bar設計1對引物，分別為bar F（5-C?G?G-ATGAGCCCAGAACGACGCCC-3）和bar R（5- CGGTCAGATCTCGGTGACGGGCAC-3），擴增產物長度為549 bp。以提取的轉基因甘蔗葉片DNA為模版，進行PCR檢測。以pCAMBIA3300- SoTUA-Bar重組質粒作為陽性對照，甘蔗品種ROC22野生型植株（WT）為陰性對照，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠后使用膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit，Bioflux公司）對PCR產物進行回收，并送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.4 ?轉SoTUA基因甘蔗低溫脅迫下基因的表達分析

1.4.1 ?總RNA的提取及cDNA的合成 ?采用Trizon試劑（康為世紀，中國）提取甘蔗葉片總RNA，具體操作按Trizon試劑盒說明書進行。以RNA為模板，參照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，日本）進行，cDNA于80 ℃保存。

1.4.2 ?低溫脅迫處理下SoTUA基因的RT-qPCR分析 ?以轉基因甘蔗株系及野生型（WT）甘蔗不同處理天數（0、5、10 d）葉片的cDNA為模板，以甘蔗GADPH基因作為內參[16]，SoTUA為目的基因，采用Primer Express 3.0分別設計引物并進行篩選。內參基因和SoTUA基因的基因熒光定量的引物見表1。

1.4.3 ?低溫脅迫處理對轉基因甘蔗株系中SoTUA基因的RT-qPCR分析 ?分析采用SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）試劑盒，共20 μL體系包括cDNA模板（50 ng/μL） 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM （TaKaRa，日本）10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.8 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。內參和目的基因分別設技術重復3次。參照張保青[15]報道利用2CT法計算相對表達量。

1.5 ?測定項目及方法

可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍法[19]測定，丙二醛（MDA）含量采用TCA法測定[20]，超氧化物歧化酶（SOD）活性用NBT化學還原法測定[20]，過氧化物酶（POD）活性用愈創木酚法測定[21]，均以鮮重計。

1.6 ?數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計算實驗數據并制作出柱狀圖，利用SPSS20.0統計軟件對低溫脅迫0、5、10 d的α-微管蛋白表達量與各生理指標進行相關性分析[22]，在P<0.05水平上進行方差分析。運用隸屬函數分析低溫脅迫10 d時各生理指標的結果，進行轉基因6個株系和對照的抗寒性的綜合評價[15]，計算方法如下：

2.2 ?PCR檢測結果

甘蔗PCR結果如圖2所示，在正對照和轉基因株系條帶在549 bp位置，H2O與野生型甘蔗549 bp無條帶，出現2條帶的原因可能是由于引物特異性較差。將轉基因PCR 549 bp處產物經膠回收純化后測序，結果顯示與目的基因擴增片段的序列一致，說明6個甘蔗株系均為轉SoTUA基因甘蔗。

2.3 ?RNA提取結果

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖3）所示，WT野生型甘蔗和6個轉基因甘蔗株系28S與18S、5S條帶清晰、銳利、無拖尾彌散現象，可進行后續實驗。

2.4 ?低溫脅迫下SoTUA基因RT-qPCR分析

如圖4所示，隨著低溫脅迫的時間增加，WT和轉基因株系的SoTUA基因的相對基因表達量均呈上調表達，總體上變化趨勢一致，其中在0～5 d上調表達較為緩慢，5～10 d上調表達急劇;0 d時，T4表達量最高，T4、T6顯著高于野生型甘蔗;處理5 d時，WT的SoTUA基因的相對表達量低于轉基因株系，且與T1、T2、T3、T4、T6株系達到顯著性差異（P<0.05）;10 d時，所有轉基因株系的SoTUA基因表達量高于WT，其中T1和T3表達量分別是WT的2.2和1.7倍。

2.5 ?低溫脅迫下轉SoTUA基因甘蔗的生理生化變化

2.5.1 ?低溫脅迫下甘蔗葉片可溶性糖含量的變化 ?由圖5可知，在低溫脅迫下，WT和轉基因甘蔗的可溶性糖含量均呈上升的趨勢，上升的幅度隨脅迫時間不斷增大，株系與株系之間上升幅度有所不同。0 d時，WT可溶性糖含量顯著高于轉基因甘蔗T1、T2、T3、T4、T6，與T5無顯著性差異。5 d時，轉基因甘蔗T2可溶性糖含量顯著高于WT，是WT的1.7倍。在10 d時，轉基因株系T2、T3的可溶性含量急劇增加，顯著高于WT，分別是WT的3.2和2.6倍;轉基因株系T1、T5、T6與WT可溶性糖含量增加緩慢，無顯著性差異;WT的可溶性糖含量顯著高于轉基因株系T4。

2.5.2 ?低溫脅迫下甘蔗葉片可溶性蛋白含量的變化 ?如圖6所示，在低溫脅迫下，不同株系甘蔗的可溶性蛋白含量的變化趨勢各有不同，野生型甘蔗WT、轉基因甘蔗株系T1、T3、T5、T6的可溶性蛋白含量逐漸降低，轉基因株系T2、T4呈現先降低后增高的趨勢。在0 d時，WT的可溶性蛋白含量與轉基因株系T1無顯著差異，但顯著低于其他轉基因株系;5 d時，轉基因株系T3、T6的可溶性蛋白含量顯著高于其他株系，分別是WT的1.5、1.4倍，而轉基因株系T2、T4顯著低于WT;10 d時，與5 d相比轉基因株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量略有下降，轉基因株系T2、T4分別為5 d時的1.6、1.9倍，轉基因株系T1、T2、T3、T6顯著高于WT。

2.5.3 ?低溫脅迫下甘蔗葉片MDA含量的變化 ?如圖7所示，在0 d時，轉基因株系T6的MDA含量顯著大于其他株系，而其他株系間無顯著性差異。低溫處理后，WT和轉基因株系的MDA含量總體呈一個上升的趨勢，5 d時，WT的MDA含量顯著高于轉基因甘蔗T2、T4、T5、T6;10 d時，WT的MDA含量急劇升高，是5 d的1.7倍，且顯著高于轉基因株系，轉基因株系T3的略下降，而在轉基因株系中T5的MDA含量較高，與其他轉基因株系無顯著性差異。

2.5.4 ?低溫脅迫下甘蔗葉片POD活性的變化 ?由圖8可知，在低溫脅迫下，轉基因甘蔗和WT葉片的POD活性均呈下降的趨勢。在低溫處理0 d時，轉基因株系T1、T2、T5、T6的POD值顯著高于WT、T3、T4。在5 d時，轉基因甘蔗T1、T2、T3、T5、T6的POD活性顯著高于野生型WT，其中轉基因T1的POD值是WT的1.6倍，且顯著高于其他轉基因株系。10 d時，轉基因株系T3的POD活性急劇下降，且顯著低于WT和其他轉基因株系;轉基因T5的下降較緩慢，仍顯著高于WT，是WT的1.8倍。

2.5.5 ?低溫脅迫下甘蔗葉片SOD活性的變化 ?由圖9可知，在低溫脅迫下，轉基因甘蔗T1、T2、T4、T6株系呈現先升高后下降的趨勢，而野生型甘蔗、轉基因T3、T5株系則呈現上升的趨勢。在0 d時，轉基因甘蔗T1的SOD活性顯著高于WT，而野生型甘蔗SOD活性顯著高于T2、T3、T4、T5、T6;5 d時，轉基因甘蔗株系T2、T4、T5的SOD活性急劇升高，且顯著高于WT，分別是WT的2、2.7、1.4倍;10 d時，轉基因株系T5的SOD活性達到最大值，與WT、T4無顯著性差異，而T2達到最小值，顯著小于WT。

2.6 ?不同株系的耐寒性綜合評價

2.6.1 ?甘蔗葉片各生理生化指標的相關分析 ?由表2反映了低溫處理0、5、10 d的SoTUA基因相對表達量、MDA含量、SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量6個指標間的相關性。由表2可知，在整個低溫期間，SoTUA基因相對表達量與可溶性糖含量呈極顯著正相關，與可溶性蛋白含量、POD活性呈負相關，與SOD活性呈正相關但不顯著，與MDA含量呈顯著正相關;可溶性蛋白含量與SOD活性呈極顯著負相關，與POD活性呈顯著正相關;POD活性與可溶性糖含量、丙二醛含量呈顯著負相關。

2.6.2 ?隸屬函數綜合評價 ?植物抗寒能力的強弱是由多種因素相互作用協同調控的，綜合評估多個指標可以彌補單因素評價的片面性，綜合反映植物的抗寒性。本研究應用處理10 d時的超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化物酶活性、丙二醛含量指標的測定值，利用隸屬函數對不同甘蔗株系進行抗寒性的綜合評估。計算結果SOD活性、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、POD活性、MDA含量的權重系數分為20.17、23.90、15.21、22.34、17.96，其中可溶性蛋白的權重系數最大，說明可溶性蛋白對轉基因甘蔗抗寒能力影響最大。研究表明，按照綜合評價值，各品系抗寒性強弱排序為T3>T2>T1> T5>T6>T4>WT。綜合評價值反映了植株的抗寒能力強弱，數值越大抗寒能力越強。

3 ?討論

低溫是影響植物生長的重要非生物因素之一，植物在低溫脅迫下，激活和誘導體內的各信號通路，調控相關基因的表達抵抗脅迫[23]。植物受到脅迫時，抗性強的植株微管會瞬間解聚與重組來抵御低溫，微管穩定性越高[24-25]，抗寒能力越強，使用微管解聚藥劑可以提高植物抗寒能力[26]。張保青[15]研究表明，甘蔗在低溫誘導下，SoTUA表達量上升，并且抗寒品種比不抗寒品種SoTUA表達量高。孫波[16]發現，過量表達α-tubulin能提高煙草耐低溫性。楊洪等[27]從巴西橡膠樹克隆出HbTUA2基因，并發現在低溫下HbTUA上調表達。本研究中，隨著低溫處理的時間延長，甘蔗SoTUA基因相對表達量不斷升高，5 d和10 d時，轉基因甘蔗比野生型甘蔗的SoTUA基因相對表達量高，其中轉基因甘蔗T1株系在低溫處理10 d表達量最高，T6表達量最低。不同株系SoTUA的表達量有所區別，這可能與SoTUA基因的拷貝數和整合方式有關，需進一步研究。

微管的動態調節特性對細胞骨架重排、細胞內物質運輸等生理生化活動起重要調節作用[28]。植物在低溫鍛煉過程中改變生理和代謝從而適應低溫[29]。可溶性糖和可溶性蛋白是植物細胞中2個重要的滲透調節因子，并能保持細胞滲透平衡[30]。植物在低溫下大量積累可溶性糖和可溶性蛋白來提高細胞液濃度，增強植物保水能力，抵抗低溫。在低溫脅迫下，甘蔗的可溶性糖含量逐漸升高，抗寒性品種增幅較大[31];甘蔗不抗寒品種可溶性蛋白含量逐漸降低，而抗寒品種可溶性蛋白含量變化幅度不大[32]。本研究中，在低溫脅迫下，甘蔗可溶性糖含量逐漸增加，與劉光玲[33]研究一致，其中轉基因T2與T3增幅最大，不同株系間增幅不同，以野生型增幅較小;可溶性蛋白含量在轉基因株系中變化趨勢各不相同，野生型甘蔗可溶性蛋白逐漸減少，而轉基因甘蔗株系T1、T3、T6的可溶性蛋白含量在整個處理時期變化相對穩定。本研究中，0 d時，轉基因株系可溶性蛋白含量顯著高于野生型甘蔗，可能SoTUA基因過表達使得甘蔗葉片中的可溶性蛋白增加，隨著脅迫時間的增加，各株系變化趨勢沒有明顯的規律，推測可能為SoTUA基因插入位點不同，但具體的作用機理需要進一步的研究。

植物受到逆境脅迫時，發生膜脂過氧化反應，生成MDA產物，具有細胞毒性[34]。膜的穩定性是植物冷適應最主要的特征[35]。在整個低溫鍛煉過程中，甘蔗的MDA含量總體呈上升的趨勢，這與何曉童等[36]報道低溫脅迫下紅蕓豆MDA含量增加的結果一致。本研究中，WT的MDA含量在5到10 d時急劇升高，說明甘蔗受到脅迫時，細胞膜系統受到損害，WT甘蔗活性氧的生成速率大于保護酶的清除速率，導致MDA含量快速升高，而轉基因甘蔗MDA含量相對穩定，膜脂受氧化程度較小，說明轉基因甘蔗中SoTUA基因過表達起到了積極的作用。

SOD和POD是植物體內主要的抗氧化酶，其活性的變化可以反映植物抗逆能力[37-38]。植物受到逆境脅迫時，SOD 活性會迅速升高來清除超氧陰離子自由基保護細胞膜[39]。低溫脅迫初期，轉基因甘蔗與野生型甘蔗的SOD活性呈上升趨勢，轉基因甘蔗T2、T4、T5的SOD活性增幅顯著高于野生型，推測過量甘蔗表達SoTUA基因對低溫脅迫初期SOD的活性影響較大。在低溫處理前后，野生型甘蔗SOD活性上升，說明甘蔗的SOD對低溫脅迫做出了應激反應，而10 d時，轉基因甘蔗T1、T2、T3、T6的SOD活性和處理前的變化較小，酶的活性也顯著沒有野生型高，說明SOD感知低溫信號能力較弱，原因有待進一步研究。冷脅迫過程中植物體內產生POD氧化分解過氧化氫等毒性物質[40]。本研究中，在低溫脅迫前后，甘蔗POD活性總體上呈下降趨勢，這與Tanha等[41]發現毛苕子種子在低溫下POD活性降低的結果一致。0 d時，轉基因T1、T2、T5、T6的POD活性顯著高于其他株系，且顯著高于野生型甘蔗，推測SoTUA在0 d時下對甘蔗的POD的活性有促進作用，隨著脅迫時間的延長，野生型甘蔗POD活性逐漸下降，而轉基因甘蔗的相對穩定，說明SoTUA在細胞內起保護性的作用，從而提高甘蔗耐寒性。

在低溫處理下，不同轉基因甘蔗株系的酶活變化趨勢各不相同。相關性分析結果[42]表明，SoTUA基因的相對表達量與可溶性糖含量呈極顯著正相關，推測微管參與糖的信號傳導，SoTUA基因的過表達有利于可溶性糖的積累。應用隸屬函數分析法[43-44]，對轉基因和野生型甘蔗進行排序，抗寒性強弱依次是T3>T2>T1>T5>T6>T4> WT，反映了不同轉基因甘蔗株系的抗寒能力。

4 ?結論

轉基因SoTUA甘蔗在低溫下SoTUA基因上調表達可提高甘蔗抗寒能力，且轉SoTUA基因甘蔗T2代具有遺傳穩定性。這為深入研究SoTUA在甘蔗抗寒作用的機理研究提供了參考，為篩選出穩定遺傳的優良轉基因甘蔗株系提供了理論依據和育種材料。

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