溪黃草水提物和醇提物體外抗腫瘤活性研究

孔藝 蔣永和 劉媛

【摘 要】 目的：研究溪黃草（Rabdosia Serra）水提取物和醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）、胃癌細(xì)胞（MKN-45）和食管癌細(xì)胞（TE-1）的增殖抑制作用，分析不同提取方式對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制強(qiáng)弱的差異。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）建立溪黃草不同提取物的色譜圖，MTT法檢測(cè)溪黃草不同提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞MKN-45和人食管癌細(xì)胞TE-1細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果：溪黃草水提物和醇提物的色譜圖存在差異。溪黃草水提物在人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞MKN-45和人食管癌細(xì)胞TE-1的IC50值分別是（2.05±0.19） mg/mL、（1.98±0.16） mg/mL和（1.65±0.18） mg/mL。溪黃草醇提物在上述三種細(xì)胞株的IC50值分別是（0.93±0.07 ）mg/mL、（0.68±0.22） mg/mL和（0.63±0.06） mg/mL。溪黃草水提物和醇提物的IC50值存在顯著差異（P<0.01），且溪黃草醇提物的IC50值顯著小于水提物。結(jié)論：兩種提取物均具有與濃度相關(guān)的細(xì)胞體外抑制作用，且醇提物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用顯著強(qiáng)于水提物。

【關(guān)鍵詞】 溪黃草;提取物;抗腫瘤

【中圖分類號(hào)】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）12-0008-05

Abstract：Objective To investigate the effect of water and ethanol extracts from Rabdosia serra on the proliferation of human hepatoma HepG2， human gastric carcinoma MKN-45 and human esophageal carcinoma TE-1 cell lines and analyze differences between water and ethanol extracts on inhibition of cancer cells. Method The high performance liquid chromatography （HPLC） was carried out on an Agilent SB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% acetic acid solution（B） with gradient elution， the detection wavelength was 254 nm， and column temperature was 35℃. After three cancer cell lines were treated with various concentrations of different extracts， cell viability was determined by MTT assay. Results There was difference between HPLC of water extract and ethanol extract from Rabdosia serra. The IC50 values of water extract from Rabdosia serra in human liver cancer cell lines HepG2， human gastric cancer cell lines MKN-45 and human esophageal cancer cell lines TE-1 were（2.05±0.19）mg/mL， （1.98±0.16） mg/mL and （1.65±0.18） mg/mL， respectively. Meanwhile， the IC50 values of ethanol extract from Rabdosia serra in three mentioned above cancer cell lines were （0.93±0.07） mg/mL， （0.68±0.22） mg/mL and （0.63±0.06） mg/mL， respectively. Furthermore， the IC50 value of ethanol extract in cancer cell lines was significantly lower than that of water extract （P<0.01）. Conclusion Two different extracts decreased HepG2， MKN-45 and TE-1 cell viability in a concentration-dependent manner， furthermore， the inhibitory effect of ethanol extract on cell proliferation was stronger than that of water extract.Keywords：Keywords： Rabdosia Serra， Extract， Anti-tumor

溪黃草為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載的唇形科植物線紋香茶菜Isodon striatus（Benth.）Kudo或溪黃草Isodon sorra（Maxim.）Kudo的干燥地上部分[1]。溪黃草具有清熱解毒、涼血散瘀、利濕退黃等功效[2]，主要應(yīng)用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾病，臨床療效確切[3]。

近年來(lái)，關(guān)于溪黃草體外抗腫瘤活性研究較多[4-12]。溪黃草水提物以時(shí)間依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖[4]，溪黃草醇提物在體外可分別抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]，但尚未見(jiàn)關(guān)于兩者抗腫瘤活性差異的研究。另一方面，中醫(yī)理論認(rèn)為溪黃草具有保肝利膽的作用，研究也表明溪黃草提取物可抑制肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。目前尚未見(jiàn)關(guān)于溪黃草不同提取物對(duì)人肝癌HepG2、胃癌 MKN-45和食管癌TE-1細(xì)胞株增殖影響的對(duì)比研究，其提取物對(duì)其他消化道腫瘤是否也具有體外抗腫瘤活性有待研究。本研究采用水和乙醇兩種不同的溶劑對(duì)溪黃草進(jìn)行提取，比較其水提物和醇提物的色譜圖差異，并在體外檢測(cè)其對(duì)HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株增殖的影響，旨在為進(jìn)一步研究溪黃草在肝癌、胃癌和食管癌中具有體外抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 溪黃草（批號(hào)171001、171002、171003）由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司溪黃草基地提供，經(jīng)廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院田素英高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為溪黃草R.serra（Maxim）Hara。人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃癌細(xì)胞MKN-45由廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院蔡祥勝博士饋贈(zèng)，人食管癌細(xì)胞株TE-1由廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院劉乃華博士饋贈(zèng)。甲醇和甲酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）。DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。DMSO（細(xì)胞用無(wú)菌級(jí)）和噻唑藍(lán)粉末（Methylthiazolyldiphenyl-Terazolium Bromide，MTT）購(gòu)自sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（包括Waters2695分離單元、2996型二極管陣列檢測(cè)器、2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)Waters公司）。sartorius電子天平（廣州靚恒科學(xué)儀器有限公司）;N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）;二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)A-sheville NC公司）;GB-Ⅱ超凈工作臺(tái);Multiscan-GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溪黃草水提物的制備 稱取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁熱過(guò)濾藥液，再重復(fù)提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，置于真空冷凍干燥機(jī)低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時(shí)，40 mg溪黃草凍干粉加入細(xì)胞高糖培養(yǎng)基，超聲至完全溶解并定容為10 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 溪黃草乙醇提取物的制備 稱取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量60%乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，趁熱過(guò)濾藥液，再重復(fù)提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，置于真空冷凍干燥機(jī)低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時(shí)，400 g溪黃草凍干粉加入DMSO，超聲至完全溶解并定容為1 mL，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 高效液相色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B）梯度洗脫（0～38 min，40%A;38～42 min，40%～55%A;42～63 min，55%～60%A）;流速：0.7 mL/min;波長(zhǎng)：254 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。各取溪黃草水提物和醇提物50.0 mg，置10 mL容量瓶，加60%乙醇，超聲30 min，補(bǔ)足60%乙醇至刻度。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2，人胃癌細(xì)胞株MKN-45和人食管癌細(xì)胞株TE-1細(xì)胞用含10 %胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素溶液的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于含5% CO2、溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液。

1.3.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為溪黃草水提物和醇提物兩組，分別向三種細(xì)胞株加入不同質(zhì)量濃度的溪黃草水提物溶液（0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg/mL）或溪黃草醇提物溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5和2 mg/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔（向未接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/孔 DMEM完全培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（向含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/每孔 DMEM完全培養(yǎng)基）和溶劑對(duì)照組（向含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入200 μL/每孔 含0.05 % DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基，僅用于醇提物組）。培養(yǎng)48 h后，棄去原有含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL 的MTT溶液，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床上，避光震蕩10 min。在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度（A）值（測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm）。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，采用圖表分析軟件GraphPad Prism 5.0計(jì)算分析各組IC50值。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD570 /對(duì)照組OD570）×100%

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，使用t檢驗(yàn)，采用方差分析及后續(xù)Dunnett t檢驗(yàn)對(duì)各組與對(duì)照組相比或LSD法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊的數(shù)據(jù)分別用welch，Dunttett T3檢驗(yàn)方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溪黃草水提物和醇提物色譜圖比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版”，對(duì)溪黃草水提取物與醇提取物色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。醇提物與水提物相比，新增6個(gè)峰，分別為圖1中的3號(hào)峰（27.0 min）、6號(hào)峰（45.6 min）、10號(hào)峰（50.3 min）、11號(hào)峰（52.6 min）、12號(hào)峰（56.3 min）和13號(hào)峰（59.6 min）。缺失4個(gè)峰，分別為2號(hào)峰（20.2 min）、4號(hào)峰（28.7 min）、8號(hào)峰（46.9 min）和9號(hào)峰（48.8 min）。

溪黃草不同提取物色譜圖除色譜峰數(shù)目不同外，峰面積也不同（見(jiàn)表1）。這充分說(shuō)明不同的提取溶劑使溪黃草的化學(xué)成分在質(zhì)和量上發(fā)生明顯的變化。

2.2 溪黃草水提物和醇提物均可抑制細(xì)胞的增殖 溪黃草水提物和醇提物在HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株中的IC50值見(jiàn)表2。溪黃草水提物可抑制HepG2、MKN-45和TE-1的細(xì)胞增殖，且抑制作用在上述3株細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，溪黃草醇提物對(duì)以上3種細(xì)胞株的增殖也具有抑制作用，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但重要的是，溪黃草水提物和醇提物對(duì)每種細(xì)胞株的增殖抑制作用均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且溪黃草醇提物的IC50值顯著小于水提物，說(shuō)明溪黃草醇提物對(duì)3種不同細(xì)胞株的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于水提物。

4 討論

溪黃草的化學(xué)成分較多，藥效成分復(fù)雜。截止到2016年，從溪黃草各基源植物中已分離鑒定了近300種化合物，主要為揮發(fā)油類、萜類、多酚類、黃酮類、神經(jīng)酰胺類化合物及木脂素、甾醇、活性多糖等成分[13-19]。近來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水煎劑具有抗肝癌活性[4，20]，并證實(shí)溪黃草黃酮是溪黃草重要的藥理活性成分之一，存在于溪黃草水溶性總黃酮部位[20]。此外，張慕垚等[11]發(fā)現(xiàn)溪黃草乙醇提取物通過(guò)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)促癌性小RNA miR-1290的表達(dá)和分泌，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。林戀竹[12]對(duì)比溪黃草葉和莖乙醇提取物的HPLC圖譜，得出全草入藥的科學(xué)性，并揭示二萜類化合物是溪黃草乙醇提取物呈現(xiàn)抑菌及抗腫瘤活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用水和乙醇對(duì)溪黃草全草進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)其水提物和醇提物可分別抑制HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖。

本研究中溪黃草水提物抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的IC50值為（2.05±0.19）mg/mL。馮傳平等[20]的研究表明當(dāng)加入0.5 mg/mL溪黃草水溶性總黃酮作用HepG2細(xì)胞株48后h，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為（34.92±2.31）%，與本研究結(jié)果相近。同時(shí)水提物也可抑制MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖，且抑制作用在三株細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本課題組采用醇提物進(jìn)行研究也得出相同的結(jié)論。但值得注意的是，醇提物對(duì)HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于水提物。在我國(guó)，中藥藥的服用方法多以水煎為主。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)溪黃草醇提物具有良好的體外抗腫瘤活性，為進(jìn)一步探尋其在HepG2、MKN-45和TE-1細(xì)胞株中具有抑制細(xì)胞增殖活性的化合物提供研究方向。

本研究仍有不足之處，如尚未研究溪黃草提取物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制，以及是否具有體內(nèi)抗腫瘤活性。其次，未檢測(cè)溪黃草不同提取物不同批次之間的色譜圖差異。課題組后續(xù)將繼續(xù)深入研究，并進(jìn)一步揭示不同的提取方法對(duì)溪黃草抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的提取效率，闡明物質(zhì)組成差異，尋找溪黃草醇提物中抗腫瘤活性較強(qiáng)的化學(xué)成分。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-10 編輯：劉 斌）