發光二極管照射對大鼠高糖視網膜血管內皮細胞的光生物調節作用及其機制

張鳳久，張麗敏，王宏杰，李海波，王海明，彭向東，楊建玲

0引言

在臨床中，糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是致盲的主要疾病[1]。為此，研究DR的發病機制、預后治療手段等，成為臨床普遍關注的重點。該疾病的發病機制較為復雜，影響因素較多。現階段，在醫學技術發展的新形勢下，細胞學分析疾病的發病機制，已成為臨床研究熱點[2-3]。光生物調節作用，借助低強度淡色光、激光等，對組織或是細胞具有非損傷的調節性作用。目前發光二極管(light emitting diode，LED)作為一種新型光源在醫療領域應用迅速發展，一定功率和能量密度的LED照射能激活靶細胞，發揮與相干光源類似的生物學效應。基于此，本研究為了明確LED對大鼠高糖視網膜血管內皮細胞的光生物調節作用，加以探究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞來源原代大鼠視網膜血管內皮細胞(美國Angio-proteomie公司)購自博士德生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器胎牛血清、D-Hanks液、胰蛋白酶、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠p-Akt單克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG二抗(美國Sigma公司)及其相關配套試劑、細胞凋亡試劑盒及其相關配套試劑、流式細胞儀、激光掃描共焦顯微鏡(美國DB公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組原代大鼠視網膜血管內皮細胞在培養瓶中培養48h后傳代培養，以5×105/mL的密度接種于24孔細胞培養板中，培養時間為24h，細胞貼壁后使用無血清培養液。繼續培養24h。根據實驗方案分組：正常對照組、高糖模型組、發光二極管照射高糖組。各組均避光靜置于培養箱內。高糖細胞模型組培養基葡萄糖濃度及干預時間采用我們前期研究的結果：25mmol/L葡萄糖濃度干預48h[4]。

1.2.2發光二極管照射本組的細胞在造模48h后開始照射。將細胞放置于培養箱中，采用發光二極管紅光光源對培養箱中的細胞進行照射，參照相關文獻[5]具體照射的參數值為最大功率1W，光源波長600nm，中心光功率密度6.52mW/cm2。光源與細胞要距離至少超過2cm，光斑的直徑為2.0cm，連續照射時間為350s，12h后再次照射，共計照射次數為3次。

1.2.3 MTT細胞凋亡實驗檢測各組細胞凋亡率將細胞制成5×105個/mL細胞懸液，按照100μL/孔接種至96孔板，按細胞分組處理各孔細胞，繼續培養2～6h，直至細胞完全貼附。按體積分數10%的比例加入MTT工作液，37℃孵育2h，將板中培養基倒掉，每孔加入200μL DMSO，酶標儀檢測490nm波長下吸光度(A490)值，每組設6個復孔，重復測量3次，取平均值。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察視網膜血管內皮細胞內鈣離子變化Fluo-4/AM負載入細胞：取出培養4d的視網膜血管內皮細胞，激光共聚焦培養皿皿底及周圍用DMEM培養液潤洗3～4次，滴加Fluo-4/AM(5μmol/L)與0.02%Pluronic F127的混合溶液。細胞置于37℃恒溫培養，避光，孵育30min；取出后加入少量DMEM培養基覆蓋細胞；用激光共聚焦顯微鏡對鈣離子進行實時檢測。其方法為：用不含酚紅的DMEM培養基洗滌3次，每次3min后，繼續穩定20min；檢測熒光強度，設置激發波長488nm，綠色熒光接收通道BP:500～550nm，紅色熒光接收通道LP>580nm。

1.2.5 Western blot法檢測各組磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(P-AKT)蛋白表達收集各組細胞，采用蛋白裂解液冰上振蕩裂解20min。4℃條件下，12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法測量蛋白質量濃度。按比例加入1/4體積的4倍上樣緩沖液，100℃煮沸5min進行變性，4℃條件下，12000r/min離心5min，取上清。按每孔20μg蛋白上樣量，用質量分數10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳分離，再用濕法轉膜將蛋白轉印至PVDF膜上，用質量分數1% BSA封閉后，孵育一抗和相應二抗，其中一抗稀釋倍數均為1∶1000，二抗稀釋倍數為1∶5000;之后用ECL發光液及顯影液定影液進行蛋白的顯影定影，最終膠片讀取數據，用Image J軟件進行灰度分析。以β-actin為內參照，計算各目的蛋白相對表達水平，并計算Akt磷酸化比率。每個樣本設置6個復孔，同一樣本重復測量3次，取平均值。

2結果

2.1 LED照射對細胞凋亡的影響三組細胞凋亡率比較差異有統計學意義(F=16.891，P<0.01)。正常對照組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發光二極管照射組，差異有統計學意義(t=12.063，P<0.01；t=10.099，P<0.01)；發光二極管照射組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組，差異有統計學意義(t=4.715，P<0.01)，見表1。

2.2 LED照射對細胞內Ca2+濃度變化的影響正常對照組中細胞質微弱Ca2+熒光染色，呈綠色熒光，細胞核為藍色熒光；高糖模型組中，細胞質呈現較強烈的綠色熒光；發光二極管照射組中，綠色熒光明顯的高于正常對照組，但明顯低于高糖模型組，見圖1，經熒光像素分析三組間細胞中內Ca2+熒光像素值具有統計學意義(F=15.846，P<0.05)。正常對照組的Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組、發光二極管照射組，差異有統計學意義(t=14.577，P<0.01；t=7.900，P<0.01)；且發光二極管照射組內Ca2+熒光像素值顯著低于高糖模型組，差異有統計學意義(t=6.881，P<0.01)，見表1。

圖1 LED照射對細胞內Ca2+濃度變化的影響(×400)

2.3 LED照射對細胞中P-AKT蛋白表達的影響三組細胞中P-AKT蛋白表達明顯不同，差異有統計學意義(F=12.694，P<0.01)。正常對照組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組、發光二極管照射組，差異有統計學意義(t=9.114，P<0.01；t=2.773，P=0.014)；發光二極管照射組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組，差異有統計學意義(t=9.807，P<0.01)，見表1。

表1 三組間細胞凋亡率和Ca2+濃度變化及P-AKT蛋白表達量比較

3討論

高血糖是DM最基本的病理生理狀態，在DM血管并發癥的發生發展中起著重要作用。高血糖導致的血管滲透性增加，炎癥和內皮細胞損傷是DR發生發展的基礎。在DM的進展過程中，高血糖導致慢性微血管損傷，使得約1/10的患者出現增生性DR(proliferative DR， PDR)或糖尿病性黃斑水腫，嚴重威脅患者視力[6]。但針對DR目前仍缺乏有效的治療方法或藥物。通過現階段臨床研究發現發光二極管照射方式對一些組織細胞的光生物調節作用較為明顯[7-8]。為此，本研究重點分析了發光二極管的價值。

在本次研究中，通過分析發光二極管照射對大鼠高糖視網膜血管內皮細胞的光生物調節作用及其機制，發現上述照射方式，對光生物調節的作用較為顯著。通過對本次研究結果的分析，發現以模擬的方式，對體外與體內高血糖狀態加以評估，能夠了解到在25mmol/L的葡萄糖培養基下，可實現對抗凋亡P-AKT蛋白通路的抑制，且對視網膜血管內皮細胞鈣穩態產生較大的影響。一般來說，細胞在人體可能會出現鈣超載情況，此種現象會導致細胞代謝異常[9-10]。多種細胞的生存、凋亡信號，主要是利用P-AKT蛋白信號途徑的抑制進行傳導的。P-AKT蛋白參與到調節細胞的分裂活動、分化活動或是凋亡活動中。蘇氨酸激酶是磷酸化絲氨酸的下游靶蛋白，多種細胞因子能夠與受體相結合，產生P-AKT蛋白亞單位，從而實現對蘇氨酸激酶活化的誘導。在維持細胞正常結構、功能過程中，鈣起到了十分重要的作用。在正常狀態時，細胞借助系列性的轉運機制，可保障患者體內低鈣情況。而多種外在因素的影響致使鈣失衡，對細胞膜與線粒體造成的響應損傷等，均會在一定程度上加快細胞的不可逆性死亡。而高糖對于P-AKT蛋白信號通路作用的抑制機制，尚需要深入探究。

依據本研究結果，發光二極管照射對大鼠高糖視網膜血管內皮細胞的光生物調節作用機制加以總結。其作用機制突出體現為，利用線粒體、信號轉導表達的方式，能有效實現光生物的調節[11]。通常情況下，對于功能不正常的組織、細胞等，光生物具有一定的調節作用。但是，對于正常功能的組織或是細胞來說，光生物調節并不能夠起到較好的作用和影響。也就是說，僅在較為特定的狀況下，選擇相對合理的參數，使細胞康復作用得以發揮。發光二極管是亮度較高、效率較高且壽命較長的固體性光源，具有新穎性。目前，多項研究認為低強度的發光二極管，光生物調節作用較為明顯[12-13]。現階段對于光生物學的調節作用劑量關系，對于照射的劑量、時間和強度等，均具有明顯的差異。本次研究中結果顯示，正常對照組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組、發光二極管照射組，發光二極管照射組的細胞凋亡率顯著低于高糖模型組。正常對照組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組、發光二極管照射組，發光二極管照射組的P-AKT蛋白表達高于高糖模型組?？梢宰C實，低強度的發光二極管照射，在一定程度上激活了抗凋亡的P-AKT蛋白通路，細胞凋亡數目有所減少，且細胞膜離子通道得以開啟，可對鈣信號傳導產生直接性的影響。此外，經過低強度發光二極管照射，高糖模型組、正常對照組的差距比較明顯。分析其原因，高糖細胞模型組在照射實驗中，采用的培養基為25mmol/L的葡萄糖，這與我們前期研究工作相一致[4]。

目前，光生物調節治療的臨床研究較為廣泛，但是在DR患者治療的應用，尚且存在不夠深入現象。本次研究中，通過對低強度發光二極管照射對大鼠高糖視網膜血管內皮細胞光生物調節作用的觀察，可明確高糖對于P-AKT蛋白表達的抑制、視網膜血管內皮細胞鈣穩態均具有較大的影響，促使細胞凋亡，激活P-AKT蛋白的同時，可將其看作DR的輔助治療手段。

綜上所述，高糖環境可有效抑制蘇氨酸激酶通路活性，對視網膜血管內皮細胞鈣穩態產生影響，促使細胞凋亡，低強度的發光二極管照射可激活蘇氨酸激酶通路，降低高糖引起的細胞凋亡率。