miR-96-5p靶向FOXO4對高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響

李 歡，路 璐

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病并發(fā)癥中最嚴重的一種微血管病變，嚴重時可導(dǎo)致失明并降低患者生活質(zhì)量，其發(fā)病機制尚未完全闡明，既往研究顯示血糖持續(xù)性升高是誘導(dǎo)患者視網(wǎng)膜病變的主要原因之一[1]。因此深入探究糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制可為臨床預(yù)防糖尿病患者發(fā)生視網(wǎng)膜病變提供理論指導(dǎo)。研究表明，微小RNA-96-5p(microRNA-96-5p，miR-96-5p)在2型糖尿病患者外周血中表達下調(diào)[2]。miR-96在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心肌組織中表達下調(diào)并可能參與心肌細胞增殖及凋亡過程[3]。相關(guān)研究表明過表達miR-96可抑制宮頸癌細胞的增殖，促進細胞凋亡[4]。但miR-96-5p在糖尿病視網(wǎng)膜病變過程中的表達變化及其可能作用機制尚未見報道。靶基因預(yù)測軟件得到叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4(forkhead box O4，F(xiàn)OXO4)可能是miR-96-5p的靶基因，研究表明FOXO4在糖尿病視網(wǎng)膜中高表達，α-黑色素細胞刺激激素在抗視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激過程中表達下調(diào)[5-6]。高糖處理后的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中FOXO4表達上調(diào)[7]。但miR-96-5p在高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中的表達及其對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響，且miR-96-5p是否通過調(diào)控FOXO4的表達影響大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。因此，本研究通過體外培養(yǎng)SD大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(RRVEC)并構(gòu)建高糖模型，觀察高糖誘導(dǎo)的RRVEC中miR-96-5p與FOXO4表達變化及其對RRVEC增殖、凋亡的影響，為早期防治糖尿病視網(wǎng)膜病變研究提供理論基礎(chǔ)，以期為臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量200～220g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SCXK(濟)2012-0003。本研究經(jīng)倫理委員會審批通過。

1.1.2主要試劑胰蛋白酶、Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)基、IgG二抗均購自武漢博士德生物有限公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物有限公司；兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、cleaved-caspased-3抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠FOXO4、CyclinD1、p21、p27抗體購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；miR-96-5p模擬物(mimic)、無義miRNA(miR-NC)、FOXO4 siRNA(si-FOXO4)、FOXO4陰性對照序列(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA 3.1購自上海索寶生物科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自江蘇依萊薩生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；Multiskan Sky 酶標儀購自美國賽默飛公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2方法

1.2.1 SD大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)與鑒定參照文獻進行RRVEC分離培養(yǎng)[8]。麻醉大鼠后用脫頸法處死大鼠，消毒后摘除大鼠眼球，用乙醇浸泡30s后使用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗3次，剪切視網(wǎng)膜組織并剪碎，放入培養(yǎng)液內(nèi)，Ⅰ型膠原酶消化視網(wǎng)膜組織，30min后收集消化液，用100μm的網(wǎng)孔過濾消化液，經(jīng)1500r/min轉(zhuǎn)速離心5min(離心半徑13cm)，棄上清，向沉淀物中加入DMEM培養(yǎng)基(肝素鈉、胎牛血清)，細胞接種至24孔板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，RRVEC穩(wěn)定傳代4代后接種于蓋玻片上(密度為1×104個/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，細胞貼壁生長后取出蓋玻片，采用免疫熒光染色法鑒定細胞，并置于熒光顯微鏡下觀察，分離的細胞均呈鋪路石樣單層貼壁生長，Cy3(紅色熒光)陽性表達。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染與分組收集生長狀態(tài)良好的RRVEC，將其分為對照組(NG)：葡萄糖濃度5.5mmol/L處理；高糖組(HG)：葡萄糖濃度30mmol/L處理[9]。分別采用miR-96-5p mimic、miR-NC、si-FOXO4、si-NC轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)的RRVEC，分為HG+miR-96-5p組、HG+miR-NC組、HG+si-FOXO4組、HG+si-NC組。通過轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic后再轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXO4驗證miR-96-5p過表達是否通過抑制FOXO4表達進而促進高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖并抑制細胞凋亡，將細胞分為HG+miR-96-5p+pcDNA組、HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組。細胞轉(zhuǎn)染后放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6h后更換為含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)研究。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-96-5p和FOXO4 mRNA表達水平采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測miR-96-5p、FOXO4 mRNA表達，分別設(shè)計miR-96-5p、FOXO4基因引物并由上海生物工程股份有限公司設(shè)計合成(表1)。用Trizol、酚/氯仿提取總RNA進行qRT-PCR反應(yīng)，配置反應(yīng)體系20μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μL，cDNA 2μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye(50×)0.4μL，ddH2O 6μL。反應(yīng)條件：95℃ 5min循環(huán)1次，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。收集各樣本Ct值并采用2-ΔΔCt法計算miR-96-5p、FOXO4 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.2.4 Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達采用蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測FOXO4、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達。取對數(shù)生長期RRVEC進行實驗處理后，預(yù)冷PBS洗滌2次，棄上清液，加入蛋白裂解液，孵育20min(冰上進行)，取細胞裂解液經(jīng)轉(zhuǎn)速13000r/min離心20min，取上清并根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，20μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳反應(yīng)后用PVDF膜轉(zhuǎn)載分離蛋白，5%脫脂奶粉封閉1h，4℃條件下加入各蛋白一抗孵育過夜，次日用TBST清洗3次×10min，室溫條件下加入二抗孵育40min，TBST清洗3次×10min，滴加ECL發(fā)光液，置于成像系統(tǒng)觀察并用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值，各蛋白相對表達量為目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值。

胡人進村了，大肆搜索，很快發(fā)現(xiàn)井下藏著人，胡人把吊桶拉了上來。農(nóng)夫聽到胡人痛叫一聲，想是他去捉婦人，反被咬了一口，跟著婦人慘叫一聲，就再無聲息了。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖收集細胞RRVEC，預(yù)冷PBS洗滌，用0.1%胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，根據(jù)實驗分組將細胞接種于96孔板(1%明膠包被)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，根據(jù)分組條件處理結(jié)束前4h分別在每孔中加入20μL MTT試劑(5g/L)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h棄培養(yǎng)液，加入DMSO(150μL/孔)，室溫振蕩10min后選取570nm波長的酶標儀檢測各孔吸光度值(OD570nm)，實驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡采用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡情況。取對數(shù)生長期RRVEC進行實驗處理后，收集各組細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS清洗后經(jīng)1000r/min離心10min收集細胞，分別加入500μL Binding Buffer，加入5μL Annexin V-FITC充分混勻10min后加入5μL PI孵育5min，利用流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度并計算細胞凋亡率。實驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗通過靶基因預(yù)測軟件確定miR-96-5p與FOXO4具有連續(xù)性結(jié)合靶點，分別設(shè)計含有miR-96-5p結(jié)合位點的FOXO4 3’UTR野生型熒光素酶報告基因載體(WT-FOXO4)，并設(shè)計FOXO4 3’UTR突變后的突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-FOXO4)，將WT-FOXO4、MUT-FOXO4分別與miR-96-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染RRVEC，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞并使用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測RRVEC的相對熒光素酶活性。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。Shapiro-Wilk檢驗數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，經(jīng)Levene檢驗方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，若差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1高糖處理對RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達的影響qRT-PCR與Western blotting分別檢測高糖處理后RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達變化，結(jié)果顯示，相較于NG組，HG組細胞中miR-96-5p表達水平顯著降低(t=17.191，P<0.05)，而FOXO4 mRNA(t=20.443，P<0.05)和蛋白(t=11.714，P<0.05)表達水平均顯著升高，見圖1。

圖1 高糖處理對RRVEC中miR-96-5p和FOXO4表達的影響

2.2 miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖的影響采用miR-96-5p mimic轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)的RRVEC，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖2A)，HG+miR-96-5p組細胞miR-96-5p表達水平較HG+miR-NC組明顯升高(t=15.363，P<0.05)，表明成功提高高糖誘導(dǎo)的RRVEC中miR-96-5p表達水平。MTT檢測高糖誘導(dǎo)的RRVEC轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic 48h后細胞增殖能力變化，結(jié)果顯示(圖2B)，HG組細胞增殖活性顯著低于NG組(t=15.757，P<0.05)；HG+miR-96-5p組細胞增殖活性顯著高于HG+miR-NC組(t=13.377，P<0.05)，表明上調(diào)miR-96-5p表達可明顯促進高糖誘導(dǎo)的細胞增殖。Western blotting進一步檢測細胞增殖相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示(圖2C、2D)，與NG組相比，HG組細胞中CyclinD1蛋白表達顯著降低(t=18.783，P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平顯著升高(t=16.100、15.757，均P<0.05)；與HG+miR-NC組相比，HG+miR-96-5p組細胞中CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(t=19.498，P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平顯著降低(t=13.587、9.603，均P<0.05)，表明miR-96-5p過表達可能通過抑制p21、p27蛋白表達促進CyclinD1蛋白表達，進而促進細胞增殖。

圖2 miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖的影響

2.3 miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響，結(jié)果顯示(圖3A、3C)，高糖處理后細胞凋亡率顯著高于NG組(t=31.778，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic(HG+miR-96-5p組)后細胞凋亡率較HG+miR-NC組明顯降低(t=15.078，P<0.05)，表明高糖誘導(dǎo)可促進RRVEC凋亡，上調(diào)miR-96-5p表達可抑制高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡。Western blotting檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示(圖3B、3D)，HG組細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著低于NG組(t=10.791，P<0.05)，而Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達水平均顯著高于NG組(t=15.363、17.441，均P<0.05)；HG+miR-96-5p組細胞Bcl-2蛋白表達水平顯著高于HG+miR-NC組(t=10.804，P<0.05)，而Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達水平均顯著降低(t=8.586、12.182，P<0.05)，表明miR-96-5p過表達可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達而下調(diào)Bax、cleaved-caspased-3蛋白表達，進而抑制高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡。

圖3 miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡的影響

圖4 抑制FOXO4表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖和凋亡的影響

2.5 miR-96-5p靶向調(diào)控FOXO4的表達雙熒光素酶報告實驗顯示(圖5A、5B)，RRVEC中miR-96-5p mimic能夠顯著抑制WT-FOXO4報告載體的熒光素酶活性(t=17.192，P<0.05)，miR-96-5p與FOXO4結(jié)合位點突變后，miR-96-5p mimic對MUT-FOXO4報告基因載體的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，表明miR-96-5p能夠直接靶向RRVEC中FOXO4的3’UTR進而抑制其表達。進一步采用Western blotting法檢測miR-96-5p過表達或抑制miR-96-5p表達后FOXO4蛋白表達變化，結(jié)果顯示(圖5C、5D)，與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic的RRVEC中FOXO4蛋白表達水平受到明顯抑制(t=13.800，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-96-5p的RRVEC中FOXO4蛋白表達水平較anti-miR-NC組明顯升高(t=18.120，P<0.05)，表明miR-96-5p可直接靶向調(diào)節(jié)FOXO4表達水平。

圖5 miR-96-5p靶向調(diào)控FOXO4的表達

2.6 FOXO4過表達逆轉(zhuǎn)miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖和凋亡的作用轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic后再轉(zhuǎn)染pcDNA-FOXO4以此驗證miR-96-5p過表達是否通過抑制FOXO4表達進而促進高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖并抑制細胞凋亡。Western blotting檢測結(jié)果顯示(圖6A、6B)，轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic后再采用pcDNA-FOXO4轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)的RRVEC(HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組)，細胞中FOXO4表達水平顯著高于HG+miR-96-5p+pcDNA組(t=15.949，P<0.05)，表明細胞轉(zhuǎn)染成功。進一步檢測RRVEC增殖及凋亡變化情況，結(jié)果顯示，與HG+miR-96-5p+pcDNA組比較，HG+miR-96-5p+pcDNA-FOXO4組細胞增殖活性明顯降低(t=9.675，P<0.05，圖6C)，細胞凋亡率明顯增加(t=8.937，P<0.05，圖6D)，p21、Bax蛋白表達升高(t=11.833、8.737，均P<0.05，圖6E、6F)，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達降低(t=9.985、7.904，均P<0.05，圖6E、6F)，表明FOXO4過表達可逆轉(zhuǎn)miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的細胞增殖和凋亡的作用。

圖6 FOXO4過表達逆轉(zhuǎn)miR-96-5p過表達對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖和凋亡的作用

3討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生后血管內(nèi)皮細胞會暴露在血漿中并極易受到高血糖刺激而發(fā)生損傷，隨后破壞視網(wǎng)膜屏障，高糖持續(xù)刺激情況下可抑制視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖，還可能通過促進細胞凋亡進而促使內(nèi)皮細胞損傷[10-11]。研究表明，miRNA表達異常可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路進而影響糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡[12]。目前關(guān)于miRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生機制的研究相對較少，因此積極尋找新型miRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系對臨床預(yù)防及治療均具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p表達異常可能參與人類滋養(yǎng)層細胞的自噬和遷移損傷過程[13]。長非編碼RNA CASC2通過調(diào)節(jié)miR-96-5p/SYVN1途徑進而抑制乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移[14]。miR-96-5p通過靶向caspase-9基因進而調(diào)控肝癌細胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后RRVEC中miR-96-5p表達水平顯著降低，高糖誘導(dǎo)的RRVEC轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic而上調(diào)其表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)后細胞增殖能力明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic后細胞增殖能力明顯增強，進一步研究顯示，轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic后高糖誘導(dǎo)的RRVEC中CyclinD1蛋白表達水平顯著增高，而p21、p27蛋白表達水平顯著降低。另有研究表明，CyclinD1可正向調(diào)控細胞周期，p21、p27可負向調(diào)控細胞周期，p21、p27表達水平升高可抑制CyclinD1對細胞周期的調(diào)控作用[16-17]。說明上調(diào)miR-96-5p表達可通過上調(diào)CyclinD1的表達及下調(diào)p21、p27的表達進而促進RRVEC增殖。同時本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后RRVEC凋亡率明顯增加，miR-96-5p過表達可降低細胞凋亡率，通過檢測細胞凋亡蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p過表達Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而Bax蛋白表達水平明顯降低。相關(guān)研究結(jié)果表明，通過抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中Bax、cleaved-caspased-3的表達，增強Bcl-2的表達能夠抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，最終達到治療糖尿病血管病變的目的[18]。說明上調(diào)高糖誘導(dǎo)的RRVEC中miR-96-5p表達可通過促進Bcl-2表達及抑制Bax、cleaved-caspased-3表達，進而抑制細胞凋亡。提示miR-96-5p過表達可通過影響細胞增殖及凋亡蛋白表達進而影響高糖誘導(dǎo)的細胞增殖及凋亡，由此推測miR-96-5p上調(diào)表達可能作為臨床早期診斷及防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要分子標志物。

FOXO4可能通過調(diào)控胰島素等參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展過程[19-20]。糖尿病條件下沉默F(xiàn)OXO4表達可保護內(nèi)皮細胞，并可參與內(nèi)皮組織損傷等過程，同時胰島素及靶器官中營養(yǎng)物質(zhì)等均可影響FOXO4表達[21]。相關(guān)研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變組織中FOXO4表達水平明顯升高并可能調(diào)控血管內(nèi)皮細胞損傷發(fā)生過程[22]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)后RRVEC中FOXO4表達水平明顯升高，通過轉(zhuǎn)染si-FOXO4后發(fā)現(xiàn)RRVEC增殖活性明顯增強，細胞凋亡率明顯下降，促進CyclinD1、Bcl-2的表達，抑制p21、Bax的表達，說明抑制FOXO4表達可通過上調(diào)CyclinD1、Bcl-2的表達及下調(diào)p21、Bax的表達進而促進高糖誘導(dǎo)的細胞增殖并抑制細胞凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CFOXO4是miR-96-5p的靶基因，miR-96-5p可負向調(diào)控FOXO4表達。為驗證miR-96-5p是否通過抑制FOXO4表達進而對高糖誘導(dǎo)的RRVEC增殖及凋亡產(chǎn)生影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的RRVEC共轉(zhuǎn)染miR-96-5p mimic與pcDNA-FOXO4后細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯增加，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，而p21、Bax蛋白表達水平明顯升高，說明miR-96-5p過表達可通過下調(diào)FOXO4表達進而促進高糖誘導(dǎo)的細胞增殖并抑制細胞凋亡。提示miR-96-5p過表達能夠抑制高糖誘導(dǎo)的RRVEC凋亡并促進細胞增殖。

綜上所述，miR-96-5p在高糖誘導(dǎo)的RRVEC中呈低表達，F(xiàn)OXO4表達水平升高，上調(diào)miR-96-5p表達可促進高糖誘導(dǎo)的細胞增殖以及抑制細胞凋亡的發(fā)生，其作用機制可能是通過抑制靶基因FOXO4表達，上調(diào)下游CyclinD1、Bcl-2表達，下調(diào)p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表達，提示上調(diào)miR-96-5p表達可通過抑制FOXO4表達進而影響細胞增殖及凋亡蛋白表達而保護視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，可為臨床防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供理論依據(jù)。但關(guān)于miR-96-5p表達變化及其對下游相關(guān)信號通路的影響均需進行分子生物學(xué)研究證實。