不同波長的藍光對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的影響

鞠雅晗，湯志敏，王宇瑤，代小嬋，羅 敏，谷 平

0引言

現(xiàn)代社會中，人們的工作和生活高度依賴于手機、電腦、電視等電子設(shè)備的使用，來源于這些電子設(shè)備顯示屏的光給人們的視覺健康帶來了極大的挑戰(zhàn)[1]。藍光(400～500nm)廣泛存在于電子顯示屏的顯示光譜(400～800nm)之中，是其主要的短波光譜[2]。近年來，藍光的視覺安全問題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明，藍光對調(diào)節(jié)人體神經(jīng)內(nèi)分泌和晝夜節(jié)律有重要的影響[3]，然而，藍光對視覺系統(tǒng)安全性的影響也不容忽視。在眼內(nèi)，低于400nm的短波紫外線可大部分被角膜和晶狀體吸收，而藍光可穿透晶狀體到達視網(wǎng)膜，造成視網(wǎng)膜的損傷[4-5]。年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)是中老年人致盲的首要疾病[6]，研究表明，慢性光損傷是ARMD發(fā)病的重要高危因素之一[7]，然而視網(wǎng)膜光損傷與ARMD發(fā)病之間的具體聯(lián)系尚不明確。視網(wǎng)膜是視覺系統(tǒng)的核心組織，而視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)是整個視網(wǎng)膜功能正常運行的后勤保障細胞，RPE的功能障礙可隨后導(dǎo)致感光細胞的受損，進而導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變[8-9]。因此，我們認為，RPE的損傷是整個視網(wǎng)膜光損傷的核心和源頭環(huán)節(jié)，所以深入探討RPE的損傷及其機制是研究視網(wǎng)膜光損傷的最佳切入點。本研究通過模擬電子顯示屏的低光強藍光照射體外RPE細胞，評估和比較不同波長的藍光對RPE細胞的活性、增殖能力、視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)及炎癥指標(biāo)水平的影響，為今后藍光損傷研究和干預(yù)提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞系)購于中科院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(Gibco，美國)，CCK-8(cell-counting kit-8)試劑(Dojindo，日本)，活/死細胞染色試劑盒(Invitrogen，美國)，RNA提取試劑盒(EZ bioscience，中國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，Real-time PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國)，酶標(biāo)儀(BioTek Instruments，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，中國)，超凈工作臺(BIO-HAZARD，VCM-420，中國臺灣)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細胞株，將細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細胞融合后用0.25%胰蛋白酶進行消化及傳代，取狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2細胞分組及藍光損傷模型建立將細胞隨機分為對照組和藍光組，其中對照組細胞進行正常培養(yǎng)；藍光組細胞暴露于可發(fā)出3個不同波段藍光的有機發(fā)光二極管(OLED)顯示設(shè)備下，3個波段藍光的峰值波長分別為447、456、468nm，藍光照度約為200Lx，光照距離為2cm，在細胞融合度為60%～70%時進行藍光照射，實驗過程中使用隔光板避免不同波長的藍光之間的干擾。處理完成后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性取狀態(tài)良好的細胞消化并離心后，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，制成細胞懸液，以每孔8×103個細胞接種于96孔板，對照組細胞進行正常培養(yǎng)，藍光組細胞分別經(jīng)相應(yīng)波長的藍光照射0、24、48、72h，處理結(jié)束后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，4h后用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度值(A)。細胞增殖活性=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.4活/死細胞染色檢測細胞活性取狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板中，每孔4×104個細胞，將藍光組細胞置于447、456、468nm藍光下照射72h后，用PBS潤洗細胞，根據(jù)說明書配置活/死細胞染色試劑培養(yǎng)基，以每孔覆蓋細胞為準(zhǔn)，孵育30min后，熒光顯微鏡下觀察檢測，顯示綠色熒光的為活細胞，顯示紅色熒光的為死細胞。

1.2.5 Real-time PCR檢測細胞mRNA表達變化對照組細胞進行正常培養(yǎng)，藍光組細胞置于447、456、468nm藍光下照射72h后，按照RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，利用Nanodrop2000c測定RNA濃度后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)PubMed檢索的核苷酸序列進行引物設(shè)計，引物由生工生物有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，擴增40個循環(huán)。Ki-67、單核細胞趨化因子(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LRAT)、視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結(jié)合蛋白(IRBP) mRNA的相對表達量以GAPDH的表達為內(nèi)部參照，結(jié)果采用2-△△Ct法計算，以對照組表達量的倍數(shù)形式呈現(xiàn)。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1不同波長的藍光對細胞增殖活性的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，將各時間點的檢測數(shù)據(jù)根據(jù)各組細胞藍光照射0h測得的吸光度值進行歸一化處理，與正常培養(yǎng)的對照組相比，光照24h后，各藍光組細胞的增殖活性略有減弱，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；光照48、72h后，藍光組各組細胞均有明顯的增殖活性抑制現(xiàn)象，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。不同波長的藍光照射細胞不同時間(24、48、72h)后，細胞的生長速率和增殖活性均受到不同程度的影響，其中波長越短，對細胞的增殖抑制越明顯，細胞生長速率越緩慢(圖1A)。

增殖標(biāo)志物Ki-67的表達水平可間接反應(yīng)細胞的增殖能力。Real-time PCR結(jié)果顯示，藍光照射細胞72h后，藍光組各組細胞Ki-67 mRNA表達水平均降低，與對照組相比，447nm藍光組細胞Ki-67 mRNA表達下降最明顯，其次為456nm藍光組、468nm藍光組(圖1B)。綜上結(jié)果，提示波長越短的藍光對ARPE-19細胞的增殖活性影響越大。

圖1 不同波長的藍光對細胞增殖活性的影響

2.2不同波長的藍光導(dǎo)致細胞形態(tài)的變化顯微鏡下對細胞形態(tài)進行觀察，正常培養(yǎng)的ARPE-19細胞形態(tài)規(guī)則，細胞融合度良好，細胞之間緊密連接(圖2A)，藍光組細胞在不同波長的藍光照射72h后，細胞的形態(tài)發(fā)生變化，細胞融合不佳，細胞密度稀疏，其中447nm藍光組細胞形態(tài)變化最明顯(圖2B)，其次為456nm藍光組(圖2C)和468nm藍光組(圖2D)。

圖2 不同波長藍光照射后細胞的形態(tài)學(xué)改變(×100)

2.3不同波長的藍光對細胞活性的影響活/死細胞染色

結(jié)果顯示，與對照組相比，藍光組細胞在不同波長藍光照射72h時后可引起細胞不同程度的死亡(圖3)。在447、456、468nm波段中，藍光的波長越短，細胞的死亡數(shù)量越多，其中447nm藍光組細胞活性最差，提示短波長藍光對ARPE-19細胞活性影響最大。

圖3 不同波長的藍光照射對細胞活性的影響(×200)

2.4不同波長藍光對細胞視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)的影響Real-time PCR檢測各組細胞中卵磷脂視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LRAT)、視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)、視黃醛脫氫酶(RDH)、光受體視黃醇類結(jié)合蛋白(IRBP) mRNA表達，結(jié)果顯示，藍光照射72h后，各視循環(huán)功能相關(guān)指標(biāo)的基因表達均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中最短波長447nm藍光照射后對細胞視循環(huán)功能指標(biāo)的抑制作用最顯著(圖4)，表明短波長藍光對細胞的視循環(huán)功能影響最大。

圖4 不同波長的藍光對細胞視循環(huán)功能指標(biāo)mRNA表達的影響

2.5不同波長藍光誘導(dǎo)細胞炎癥因子表達的變化Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，藍光照射72h后，ARPE-19細胞中MCP-1和IL-6 mRNA表達水平均上調(diào)，其中447nm波長藍光照射后細胞中促炎因子上調(diào)最明顯(圖5)。

圖5 不同波長的藍光對細胞炎癥因子MCP-1和IL-6 mRNA表達水平的影響

3討論

隨著電子技術(shù)的發(fā)展，人們的工作和生活中越來越離不開手機、電腦、電視等電子設(shè)備的使用，來自這些顯示設(shè)備中的光，尤其是其中的藍光對人類健康的影響已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。既往研究表明，藍光可以調(diào)節(jié)人的生物節(jié)律[10]。然而，藍光亦可損害我們的視覺系統(tǒng)。近年來，視網(wǎng)膜退行性疾病尤其是ARMD在發(fā)達國家的發(fā)病率正在逐年攀升[11]，這或許與人口老齡化的發(fā)展態(tài)勢有關(guān)，但也與人們對電子設(shè)備日益嚴重的依賴性有著不可分割的關(guān)系，增長的屏幕使用時長使視網(wǎng)膜暴露在更多的藍光之下，帶來潛在的視覺安全隱患。本研究使用模擬電子設(shè)備顯示屏照度的藍光進行體外研究，可有效評估日常工作生活中顯示屏藍光對人類視覺安全的影響。

RPE細胞是視網(wǎng)膜中最重要的細胞之一，具有多種生理功能，如分泌、吞噬、屏障功能等，其負責(zé)保障視網(wǎng)膜正常功能的運行[12]。RPE細胞的損傷或死亡通常被認為是ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的核心環(huán)節(jié)[13]。本研究結(jié)果表明，藍光可造成RPE細胞的異常，包括形態(tài)改變，細胞活性下降，細胞增殖能力減弱，甚至可造成細胞的死亡，且隨著藍光波長的變短，其對RPE細胞的損傷作用越顯著。我們觀察到在短波長藍光照射下，RPE細胞顯示出更為稀疏的細胞融合度，這也從側(cè)面體現(xiàn)了RPE細胞的增殖能力減弱，通過CCK-8實驗以及增殖標(biāo)志物Ki-67 mRNA水平的檢測結(jié)果加以證實，隨著藍光波長變短，藍光對RPE細胞的增殖抑制作用越強。此外，利用活/死細胞染色實驗清楚地看到不同波長的藍光照射下RPE細胞的存活情況，藍光的照射波長越短，RPE細胞中死細胞占總細胞的比例越大。

RPE的重要生理功能之一是視循環(huán)功能[14]，即視蛋白視黃醛的代謝，這是眼睛能感知到光的生理基礎(chǔ)。RPE細胞中表達多種關(guān)鍵的視循環(huán)功能基因，如RDH[15]、CRALBP[16]、LRAT[17]、IRBP[18]等，這些視循環(huán)功能蛋白均參與視黃醛代謝，負責(zé)其合成與轉(zhuǎn)運，RPE既是視黃醛的儲存場所又是其合成場所，因此，一旦這些關(guān)鍵的視循環(huán)蛋白發(fā)生異常，視黃醛的正常轉(zhuǎn)運和代謝就無法完成，視覺功能將因此受到損害。本研究發(fā)現(xiàn)，藍光照射后，RPE細胞視循環(huán)功能指標(biāo)的基因表達水平明顯下降，意味著RPE細胞的視循環(huán)功能受損，其異常可能導(dǎo)致視覺障礙甚至失明。雖然ARMD病因仍然不明確，但是視黃醛代謝的障礙可能是其重要的誘導(dǎo)因素之一[19]。此外，RPE作為血-視網(wǎng)膜屏障的外部屏障起著重要的作用，因此RPE的功能障礙直接影響血-視網(wǎng)膜屏障的完整性，而RPE功能受損后繼而將受到炎癥攻擊，導(dǎo)致RPE炎癥指標(biāo)的異常，從而誘導(dǎo)ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的進展[20]。既往研究表明，RPE功能異常引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的關(guān)鍵誘發(fā)因素[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，藍光可在體外誘導(dǎo)RPE細胞促炎因子MCP-1和IL-6 mRNA表達明顯上調(diào)，表明RPE的光損傷確實可造成其炎癥水平的異常。研究報道，促炎因子MCP-1等在視網(wǎng)膜退行性疾病(如ARMD)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[22]，提示光損傷后RPE異常的炎癥因子水平可能會導(dǎo)致ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)生。然而，本研究尚未對炎癥因子的異常表達機制進行研究，將在今后的研究中進行深入探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明藍光照射可引起RPE細胞的異常，包括細胞活性下降、細胞增殖能力減弱甚至細胞死亡。此外，藍光下調(diào)了RPE細胞視循環(huán)功能相關(guān)基因的表達，同時可引起RPE細胞的炎癥指標(biāo)水平異常，表現(xiàn)為促炎因子IL-6和MCP-1的基因表達升高。與長波長藍光相比，短波長藍光對RPE細胞的損傷作用更明顯。本研究旨在觀察不同波長的藍光對維持視網(wǎng)膜功能的RPE細胞的損傷作用，探討對視覺系統(tǒng)損害的藍光波長的特點，為視網(wǎng)膜的藍光損傷研究提供了新的實驗依據(jù)，也為今后顯示設(shè)備視覺安全性的發(fā)展給予了一定的指導(dǎo)意義。