響應(yīng)面法優(yōu)化風味米曲制備工藝

吳 健，何 偉，王建成，楊玉蓉，藍彩紅，劉盛鋼，楊 濤*

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410000；2.長沙市食品藥品信息與審評認證中心，湖南長沙 410000；3.四川邛崍金六福崖谷生態(tài)釀酒有限公司，四川成都 611530）

近些年來與米香型白酒風味相關(guān)的研究方興未艾，主要集中在白酒發(fā)酵工藝與原料的探索[1]、酒體后期催陳效果研究[2]、不良苦味的消除[3]以及功能菌的增香效果評估[4]等。本課題組前期也針對性地做了產(chǎn)香酵母的篩選與產(chǎn)酯規(guī)律研究[5]，為米香型白酒的風味改善提供了技術(shù)支撐，但均未對改善風味的工藝進行進一步分析和優(yōu)化。

酒曲是富含微生物的發(fā)酵引物，素有“曲是酒中骨”的說法[6]。米曲是指以大米粉、米糠等為原料，經(jīng)接種種曲后制備得到的一類優(yōu)質(zhì)釀酒小曲，有以生料制曲的邛崍米曲，以熟料制作顆粒曲與散曲的廈門白曲，以及紹興酒藥、寧波白藥等[7-8]。

國外在釀酒領(lǐng)域?qū)τ诋a(chǎn)香酵母的利用較為深入，普遍將其作為生物香料以增加產(chǎn)品的香氣多樣性，而相關(guān)的研究也不斷證實了產(chǎn)香酵母對于釀酒的積極作用[9]。將產(chǎn)香酵母用于制曲，豐富微生物的種系，對于酒體質(zhì)量的提升有良好促進作用。

本研究將異常維克漢遜酵母（Wickerhamomycesanomalus）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、克魯維畢赤酵母（Pichia kudriazevii）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共培養(yǎng)制作復配酵母種，通過對米曲制備中影響因素進行研究，利用單因素試驗及響應(yīng)面法對風味米曲的制備工藝進行優(yōu)化，并評估了風味米曲的釀造可行性。旨在通過豐富酒曲中的功能性微生物來改善米香型白酒酒體風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料與菌株

一級秈米：金健米業(yè)股份有限公司；生麥芽：泉州市麥芽有限公司；小曲（廣西小曲樣品A、四川小曲樣品B、廈門小曲樣品C）：滿盅花釀酒設(shè)備廠；米根霉（Rhizopus oryzae）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）、克魯維畢赤酵母（Pichia kudriazevii，PK）、異常維克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus，WA）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera，SF）：本實驗室篩選鑒定得到并保藏的菌種。

1.1.2 化學試劑

重鉻酸鉀、無水乙醇、酚酞、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、硫酸：廣州凱茵化工有限公司。所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲汁培養(yǎng)基：參照黃慧芬等[5，10]的方法制備；麥芽汁培養(yǎng)基：參照陳小龍等[11]的方法制備，于115 ℃下高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；HZQ-C氣浴恒溫搖床：常州恒隆儀器有限公司；YXQ-LS-75G全自動數(shù)顯高壓滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BM1000生物顯微鏡：江南永新光學儀器有限公司；UV-2600紫外可見光分光光度計：日本島津公司；DK-98-2電熱恒溫水浴鍋：上海虔鈞科學儀器有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機：艾本德中國有限公司；JH-H5快速水份測定儀：泰州市宜信得儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 風味米曲制曲工藝流程及操作要點[12]

操作要點：

粉碎過篩：取秈米粉碎后過60目篩，作為米曲培養(yǎng)的原料。

滅菌、打散：將米粉在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后，趁熱打散。

米根霉固體米粉種曲制備：用米根霉制備純種固體米粉種曲[13]。

復配酵母共培養(yǎng)種子液的制備：取SC及3株產(chǎn)香酵母PK、WA、SF菌株試管種，挑取一環(huán)接種于裝有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于30 ℃、150 r/min氣浴搖床中活化24 h，將上述3株產(chǎn)香酵母種子活化液以106∶106∶106（CFU/mL）的比例接種到米曲汁培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)8 h后，再以106CFU/mL的濃度接種SC種子活化液，繼續(xù)共培養(yǎng)24 h，制得復配酵母共培養(yǎng)種子液。

接種培養(yǎng)：在滅菌后打散的米粉中加入25%無菌水，接種5%米根霉種，再接種酵母共培種，32 ℃培養(yǎng)72 h至米粉結(jié)塊良好，翻曲培養(yǎng)至米曲成熟后出箱，得到風味米曲。

1.3.2 風味米曲試飯的制備[13]

米香型白酒原料為大米，根霉曲直接接種米飯作為糖化發(fā)酵劑，采用試飯的方法來檢測風味米曲的質(zhì)量。

試飯的制備：取秈米50 g，按米水比1∶1.2（g∶mL）加水，115 ℃高壓滅菌15 min，用無菌藥匙趁熱攪散，要求飯質(zhì)量等于大米和所加水量之和，不足部分用無菌水補足，待米飯涼至35 ℃左右，以大米質(zhì)量1%的比例（即0.5 g）稱取風味米曲均勻地拌和到米飯中，在30 ℃固態(tài)糖化24 h后，以大米質(zhì)量的150%加水密閉發(fā)酵3 d。測定其試飯的感官評分、酯和乙醇含量。

1.3.3 風味米曲制備工藝優(yōu)化單因素試驗

在接種根霉固體種曲后8 h再接種液體酵母種共培養(yǎng)制備米曲的基礎(chǔ)上，分別考察培養(yǎng)溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、培養(yǎng)時間（36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）以及酵母添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）對風味米曲制備的影響。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化風味米曲制備工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取風味米曲制備的關(guān)鍵影響因素酵母接種量（A）、培養(yǎng)時間（B）、培養(yǎng)溫度（C）進行考察，以試飯酯含量（Y）為響應(yīng)指標進行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 分析檢測

（1）試飯指標

試飯酯含量的測定參照盧亭等[14]的方法；試飯乙醇含量的測定參照吳瓊燕[15]的方法；按國標GB/T 33405—2016《白酒感官品評術(shù)語》[16]中白酒中風味評價的標準并參照吳瓊燕[15]等的品評方法進行試飯感官評價。

（2）風味米曲理化指標

采用快速水分測定儀測定風味米曲水分含量；參照馬歌麗等[17]的方法測定風味米曲糖化力；參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[18]測定風味米曲的發(fā)酵能力。

1.3.6 風味米曲的半固態(tài)發(fā)酵驗證

對響應(yīng)面優(yōu)化制曲工藝進行試飯驗證后，以市場上的3種小曲樣品A、B、C作為對照，將風味米曲作為釀造酒曲進行半固態(tài)發(fā)酵驗證。取秈米1 000 g，按照1.3.2中的方法進行處理并攤涼后，按米質(zhì)量的1%取酒曲均勻地拌和到米飯中，在30 ℃固態(tài)糖化24 h后，加水150%，密閉發(fā)酵7 d。將發(fā)酵繆取出進行常壓蒸餾，截取頭酒后，將中段酒接至56%vol后停止接酒，并測定酒體總酸總酯含量，同時參照米香型白酒品評方法對酒體進行感官評價[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 風味米曲制備工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同培養(yǎng)溫度對風味米曲試飯指標的影響

圖1 培養(yǎng)溫度對試飯指標的影響Fig.1 Effect of culture temperature on testing indicators of steamed rice

由圖1可知，隨著培養(yǎng)溫度的不斷上升，試飯指標均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其中試飯酯含量與感官評分變化趨勢一致，在26～30 ℃的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)逐漸增高，在30 ℃時達到峰值，分別為3.04 g/L與86分，繼續(xù)升溫會導致兩者均出現(xiàn)大幅度下降。試飯乙醇含量隨著溫度在26～33 ℃范圍增加逐漸升高，并在32 ℃達到最大值（59.23 g/L），繼續(xù)升溫試飯乙醇含量減少。綜合考慮，選擇最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。

溫度是影響微生物生長的重要因素，但菌體生長的最適溫度與代謝產(chǎn)物累積的最佳溫度通常并不相符，這可能與發(fā)酵體系中的物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)，代謝產(chǎn)物的生成會受到發(fā)酵體系中的物質(zhì)調(diào)控，與ROLLERO S等[19]的研究結(jié)果一致。

2.1.2 不同培養(yǎng)時間對風味米曲試飯指標的影響

圖2 培養(yǎng)時間對試飯指標的影響Fig.2 Effect of culture time on testing indicators of steamed rice

由圖2可知，培養(yǎng)時間在36～72 h內(nèi)，試飯酯含量、乙醇含量與感官評分3個試飯指標均隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增高，并在72 h出現(xiàn)了峰值，分別為3.05 g/L、58.37 g/L以及87分。培養(yǎng)時間＞72 h之后，試飯酯含量、乙醇含量稍微下降，感官評分出現(xiàn)了較大程度的降低。綜合考慮，選擇最適培養(yǎng)時間為72 h。

2.1.3 不同酵母接種量對風味米曲試飯指標的影響

酒曲微生物的菌群多樣性與酒體中各種微量成分的形成密切相關(guān)，不同的接種比例會直接影響到代謝物質(zhì)的含量[20]。

圖3 酵母接種量對試飯指標的影響Fig.3 Effect of yeasts inoculum on testing indicators of steamed rice

由圖3可知，酵母接種量在0.6%～1.0%范圍內(nèi)增加，試飯酯含量、乙醇含量及感官評分也隨之升高，3個指標均在1.0%的接種比例下達到峰值，分別為3.46 g/L、65.35 g/L以及91分。隨著接種量的進一步增加，3個試飯指標均隨之降低，繼續(xù)加大酵母接種量不利于發(fā)酵平衡以及產(chǎn)物的代謝。綜合考慮，選擇最適酵母接種量為1.0%。

產(chǎn)香酵母可通過生物轉(zhuǎn)化形成芳香酮以及酯類物質(zhì)[21]，在一定范圍內(nèi)，增大產(chǎn)香酵母的接種比例可增加其代謝產(chǎn)物的濃度，但超出適宜范圍之后，會對根霉的生長造成不利影響，這可能是引起試飯指標下降的一個重要原因。

2.2 風味米曲制備工藝優(yōu)化的Box-Behnken響應(yīng)面試驗

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以試飯酯含量（Y）為響應(yīng)值，選擇顯著影響試飯指標的因素酵母接種量（A），培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時間（C）進行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken experiments design

續(xù)表

對試飯酯含量（Y）進行二次項模型的回歸擬合分析，得到回歸方程為：

2.2.2 試飯酯含量的方差與可信度分析

進一步對表2各組試驗的結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，針對試飯酯含量選用二次項模型進行回歸擬合，模型P值＜0.000 1，具有極顯著差異，擬合精度良好，可用該模型進行后續(xù)的優(yōu)化分析；同時失擬項P值＞0.05，差異不顯著，說明該二次項模型在整個回歸區(qū)域類擬合較好[22]，試飯酯含量的模型擬合成功。同時，從各因素在模型擬合中的P值來看，一次項A、B、C，二次項A2與C2對試飯酯含量有極顯著的影響（P＜0.01）；交互項AB、AC對試飯酯含量有顯著性的影響（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

模型的決定系數(shù)R2與調(diào)整決定系數(shù)R2adj分別為0.992 6、0.981 8，證明擬合后99.26%的試飯酯含量可由模型解釋，98.18%的變化來源于考察的變量，調(diào)整優(yōu)化后的模型能充分說明工藝情況。變異系數(shù)為1.486 1%，在實驗范圍內(nèi)的變異較小，數(shù)據(jù)的離散程度在可接受范圍內(nèi)。

2.2.3 試飯酯含量的響應(yīng)面分析及驗證試驗

對風味米曲試飯指標的響應(yīng)面進行分析，各因素交互作用對試飯酯含量影響的響應(yīng)面及等高線見圖4。

圖4 酵母接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間交互作用對試飯酯含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum,culture temperature and time on ester contents of steamed rice

由圖4可知，AB、AC交互作用對于試飯酯含量均有顯著影響，以試飯酯含量為響應(yīng)指標，擬合出的最佳制備工藝參數(shù)為酵母接種量1.03%、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間72.98 h，此優(yōu)化條件下試飯酯含量預測值為3.64 g/L。為了便于實際操作，將理論最優(yōu)的風味米曲制備工藝修正為酵母接種量1.0%，培養(yǎng)時間73 h，培養(yǎng)溫度30 ℃。在此優(yōu)化制備工藝條件下，得試飯的酯含量實際值為3.65 g/L，與理論值基本一致，表明響應(yīng)面擬合成功，可為實際的制曲提供參考。

2.3 風味米曲的質(zhì)量指標檢測

由圖5可知，4種小曲的水分含量均≤13%，其中小曲A的水分含量最高，與其余3種小曲相比差異具有顯著性（P＜0.05），而小曲C、小曲B、自制風味米曲則無明顯區(qū)別（P＞0.05）。風味米曲的糖化力達到423.77 U/g，與小曲A、小曲B無明顯差異（P＞0.05），但顯著高于小曲C（P＜0.05）。而從發(fā)酵力指標可看出，風味米曲達到2.24 g/（g·72 h），與其余小曲相比具有顯著性差異（P＜0.05），具備良好的發(fā)酵能力。

圖5 風味米曲的半固態(tài)發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Semi-solid fermentation results of flavor rice starter

2.4 風味米曲的半固態(tài)發(fā)酵制備米香型白酒驗證

選擇了不同產(chǎn)區(qū)的優(yōu)質(zhì)小曲樣品A、B、C作為對照，進行實際釀造，研究了最優(yōu)擬合工藝下制備出的風味米曲的釀造效果，結(jié)果見圖6。

圖6 風味米曲的半固態(tài)發(fā)酵驗證試驗結(jié)果Fig.6 Verification tests results of semi-solid fermentation results of flavor-producing rice starter

由圖6可知，4種酒曲的釀造效果具有明顯差異。其中風味米曲的總酯含量與其余3種小曲具有顯著性差異（P＜0.05），產(chǎn)量最高，達到了6.87 g/L；此外總酸含量、感官評分值分別為1.63 g/L、92分，同樣與其余酒曲具有顯著性差異，均為最優(yōu)。產(chǎn)香酵母的添加，使得風味米曲的產(chǎn)酯能力與產(chǎn)酸能力明顯提升，這對酒體感官品質(zhì)起到了很大的貢獻作用，極大的改善了米香型白酒香氣。為優(yōu)質(zhì)米曲的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

3 結(jié)論

用3株產(chǎn)香酵母與1株釀酒酵母制備復配酵母種，與純種米根霉菌共培養(yǎng)制備風味米曲，以試飯感官評價分值、試飯酯含量、試飯乙醇含量為評價指標，針對酵母接種比例、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間進行單因素試驗。在此基礎(chǔ)上，以米曲的試飯酯含量為響應(yīng)指標，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了制曲工藝，建立了風味米曲制作工藝的二次項回歸模型，擬合出的理論最優(yōu)工藝為酵母接種量1.0%，培養(yǎng)時間73 h，培養(yǎng)溫度30 ℃。在此優(yōu)化制備工藝條件下，試飯的酯含量為3.65 g/L。

風味米曲的質(zhì)量指標檢測與半固態(tài)發(fā)酵釀酒實驗結(jié)果顯示，風味米曲水分含量為10.58%，糖化力為423.77 U/g，發(fā)酵力為2.24 g/（g·72 h）。經(jīng)半固態(tài)法實際釀酒后，酒體總酯含量達到了6.87 g/L，總酸與感官評分分別為1.63 g/L、92分，具備米香型白酒典型風格，且風味明顯提升。利用產(chǎn)香酵母制備風味米曲，對米香型白酒起到了明顯的增香作用。