酶解對霉菌發酵乳風味的影響

汪亞彬，周 蕾，謝擁葵，汪建明*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.北京市朝陽區食品藥品安全監控中心，北京 100123；3.新疆天牛乳業有限公司，新疆伊犁 835704）

牛奶營養豐富，能夠提供維持人體健康需要的膳食營養素[1]。對生牛乳、生羊乳或乳粉進行發酵處理，還可以產生幫助機體腸胃蠕動和胃液分泌的有機酸[2]，維持機體健康。

發酵乳即此類乳制品的統稱，其中包括干酪、酸牛乳、發酵奶油、開菲爾等繁多種類[3]，張蘭威[4]根據發酵乳發酵過程中的優勢菌種不同，將其劃分為了Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。發酵乳的pH一般較低，酸性條件可以抑制大部分細菌的生長繁殖，但無法抑制耐酸性微生物（如霉菌、酵母菌等）的污染[5]。經研究發現，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌對霉菌發酵乳有明顯的抑菌效果[6]。

隨著我國居民生活質量的提高，越來越多的人開始重視乳制品的攝入，近年來我國發酵乳制品的產銷量持續攀升[7]。發酵乳制品中的風味物質一般是由發酵菌群產生的乳酸和各種揮發性有機芳香物質組成的，其中包括碳氫化合物、酯類、醇類、醛類等[8-9]。根據周海珍[10]的研究，在霉菌發酵牛乳制備干酪工藝中宜選用卡地干酪青霉組中的白酪青霉，有助于發酵乳制品中風味物質的產生。當生牛乳等天然奶產品被酶解后，產品的奶香更為柔和適口，且增加了乳制品的風味[11]。在乳品行業中，應用酶解反應可有效改善乳制品的品質[12]。其中乳脂肪更是與乳制品的感官品質關系密切[13]，在被酶解的過程中可以產生大量風味物質，不僅使產品更具風味，而且可以延長產品的保質期、增加體系的穩定性[14]。發酵乳酶解后會產生一些非揮發性風味物質，如游離氨基酸（free amino acid，FAA）和游離脂肪酸（free fat acid，FFA）。一般用高效液相色譜法測定游離氨基酸，用氣相色譜法測定游離脂肪酸；對于一些揮發性風味物質主要采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）進行研究[15-16]。

本試驗通過采用脂肪酶和蛋白酶對霉菌發酵乳進行酶解，以酶解液的游離脂肪酸含量、脂解率和游離氨基酸含量為檢測指標，采用單因素及正交試驗優化脂肪酶和蛋白酶酶解工藝條件，以獲得風味物質豐富的發酵乳產品，為進一步增強牛乳風味的研究與應用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂乳粉：新疆天牛乳業有限公司；脂肪酶PICCANTASER800（10000U/g）、蛋白酶MAXIPROCPP（15100U/g）：帝斯曼（中國）有限公司；卡地青霉（Penicilium candidum）：杜邦丹尼斯克公司；所有分離用有機溶劑（分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

LE438系列pH電極，AB204-N型電子分析天平：梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HJ-6A數顯恒溫多頭磁力攪拌器：上海易友儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 霉菌發酵乳的制備

將全脂乳粉以1∶5（g∶mL）的比例溶解倒入無菌三角瓶中，進行105 ℃、15 min滅菌處理，在無菌條件下接種5%活化后的卡地青霉霉菌，于29℃、95r/min恒溫搖床培養4 d[17]。

1.3.2 脂肪酶酶解工藝條件優化

以脂肪酶酶解液FFA含量和脂解率為評價指標，分別考察脂肪酶添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）及酶解時間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對脂肪酶酶解的影響。

在單因素試驗的基礎上，以脂肪酶添加量（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）為3個因素，每個因素選擇3個水平，以酶解后發酵乳的FFA含量為評價指標，設計L9（33）正交試驗優化酶解工藝條件，脂肪酶酶解條件優化正交試驗因素與水平見表1。

表1 脂肪酶酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization by lipase

1.3.3 蛋白酶酶解工藝條件優化

以蛋白酶酶解液FAA含量為評價指標，分別考察蛋白酶添加量（0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）及酶解時間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對蛋白酶酶解的影響。

在單因素試驗的基礎上，以蛋白酶添加量（D）、酶解溫度（E）和酶解時間（F）為3個因素，每個因素選擇3個水平，以酶解后發酵乳的FAA含量為評價指標，設計L9（33）正交試驗優化酶解工藝條件，蛋白酶酶解條件優化正交試驗因素與水平見表2。

表2 蛋白酶酶解條件優化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization by protease

1.3.4 測定方法

游離脂肪酸含量（FFA）：采用滴定法進行測定[18]；游離氨基酸（FAA）含量：采用甲醛滴定法進行測定[19-20]。

酸值根據標準LS/T 6107—2012《動植物油脂酸值和酸度測定自動滴定分析儀法》進行測定；皂化值根據標準GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定》進行測定，并做空白對照實驗。

脂解率計算公式如下：

式中：AV為酸值，mg/g；SV為皂化值，mg/g。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶酶解工藝條件優化單因素試驗結果

2.1.1 酶添加量對發酵乳風味物質中FFA含量和脂解率的影響

圖1 不同脂肪酶添加量對脂肪酶酶解發酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.1 Effects of different lipase additions on free fatty acid and lipid hydrolysis rate of fermentation liquid by lipase

由圖1可知，在脂肪酶添加量為1.5%時，FFA含量和脂解率最大，分別為7.19%和67.54%。當酶底物的添加量和底物達到合適的配比時，酶的反應效果會更好，酶活力也相對較強，添加量過多或過少會使酶和底物的接觸過大或不足，反應效果會受影響，導致酶解過度或不足，產生的FFA含量少。因此選擇脂肪酶的最佳添加量為1.5%進行后續試驗。

2.1.2 酶解溫度對發酵乳風味物質中FFA含量和脂解率的影響

圖2 不同酶解溫度對脂肪酶酶解發酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.2 Effects of different enzymatic hydrolysis temperature on free fatty acid and lipid hydrolysis rate in fermentation liquid by lipase

由圖2可知，酶解溫度在45 ℃時發酵液的FFA含量和脂解率最高，分別為7.33%和66.39%。當酶解溫度低于45 ℃之前酶活力不高，酶解反應不徹底，酶解效果不佳；當酶解溫度高于45 ℃之后，會使酶活力下降，使得酶解反應進行緩慢，FFA含量和脂解率較低。因此選擇脂肪酶的最佳酶解溫度為45 ℃進行后續試驗。

2.1.3 酶解時間對發酵乳風味物質中FFA含量和脂解率的影響

圖3 不同酶解時間對脂肪酶酶解發酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.3 Effects of different enzymatic hydrolysis times on free fatty acid and lipid hydrolysis rate in fermentation liquid by lipase

由圖3可知，酶解5 h后得到的發酵液FFA含量和脂解率最高，分別為7.76%和66.73%。在3～5 h時，隨著酶解時間的延長，FFA含量和脂解率逐漸升高，說明酶活力大，反應較快，脂肪酶發揮作用主要是在作用位點。隨著反應的進行，酶的作用點變少，使酶解反應變慢，脂解率降低。因此選擇脂肪酶的最佳酶解時間為5 h進行后續試驗。

2.2 脂肪酶酶解工藝條件優化正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以酶添加量、酶解溫度和酶解時間為試驗因素，以FFA含量為評價指標進行正交試驗，確定脂肪酶最佳酶解條件。L9（34）正交試驗結果與分析見表3。

表3 脂肪酶酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis process optimization by lipase

由表3可知，各因素對游離脂肪酸的影響大小次序為B＞A＞C，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。綜合考慮各因素k值和R值，確定脂肪酶酶解最佳條件為A2B2C2，即脂肪酶添加量為1.5%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為5 h。在此條件下進行3次平行驗證試驗，游離脂肪酸含量為8.17%。

2.3 蛋白酶酶解工藝條件優化單因素試驗結果

2.3.1 酶添加量對發酵乳風味物質中FAA含量的影響

圖4 不同蛋白酶添加量對蛋白酶酶解發酵液游離脂肪酸的影響Fig.4 Effects of different protease additions on free fatty acid in fermentation liquid by protease

由圖4可知，在蛋白酶添加量為0.15%時，FAA含量最大為0.392%。當添加量＜0.15%之前，蛋白酶與底物接觸面大，隨著含量增加，酶活力增加，FAA含量逐漸增加；當添加量＞0.15%之后，加酶量過多蛋白酶與底物接觸不完全，使發酵受抑制，FAA含量逐漸降低。因此選擇蛋白酶的最佳添加量為0.15%進行后續試驗。

2.3.2 酶解溫度對發酵乳風味物質中FAA含量的影響

由圖5可知，酶解溫度在55 ℃時，FAA含量最大為0.406%。當酶解溫度低于55 ℃時，蛋白酶活力較弱；當酶解溫度高于55 ℃之后，過高的溫度會使蛋白結構損壞，發生變形甚至失活，酶解溫度過低或過高都不能很好得使蛋白酶發揮作用。因此選擇蛋白酶的最佳酶解溫度為55 ℃進行后續試驗。

圖5 不同酶解溫度對蛋白酶酶解發酵液游離脂肪酸的影響Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis temperature on free fatty acid in fermentation liquid by protease

2.3.3 酶解時間對發酵乳風味物質中FAA含量的影響

圖6 不同酶解時間對蛋白酶酶解發酵液游離脂肪酸的影響Fig.6 Effects of different enzymatic hydrolysis time on free fatty acid in fermentation liquid by protease

由圖6可知，酶解時間為5 h時測得的FAA含量最高為0.371%，當酶解時間＜5 h時，可能是酶解時間太短使得酶解不徹底，FAA含量降低；而酶解時間過長，會導致酶解產生的多肽物質對酶解反應的進行產生一定的抑制作用，使酶解反應變慢，從而FAA含量降低。因此選擇蛋白酶的最佳酶解時間為5 h進行后續試驗。

2.4 蛋白酶酶解工藝條件優化正交試驗結果

表4 蛋白酶酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis process optimization by protease

根據單因素試驗結果，以酶添加量、酶解溫度和酶解時間為試驗因素，以FAA含量為評價指標進行正交試驗，確定蛋白酶最佳酶解條件。L9（34）正交試驗結果與分析見表4。

由表4可知，各因素對游離氨基酸影響的大小次序為D＞F＞E，即酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。綜合考慮各因素k值和R值，確定蛋白酶酶解最佳條件為D2E2F3，即蛋白酶添加量為0.15%，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為5.5 h。在此條件下進行3次平行驗證試驗，游離氨基酸含量為0.413%。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，確定脂肪酶和蛋白酶對霉菌發酵乳進行酶解的最佳工藝條件為：脂肪酶添加量為1.5%，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為5 h；蛋白酶添加量為0.15%，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為5.5 h。在此工藝條件下，發酵乳中非揮發性風味物質含量最為豐富，為進一步增強牛乳風味的研究與應用提供了基礎。