基于免疫組化法研究MMP-2、MMP-14與頸動(dòng)脈粥樣斑塊易損性的相關(guān)性

郭周穎，張淑琴，秦顥誠(chéng)，于 明，李洪娥

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性卒中發(fā)生發(fā)展的重要病理和臨床基礎(chǔ)[1，2]，其中易損斑塊的形成以及隨之形成的血栓是腦血管疾病致殘、致死的重要原因，易損斑塊主要以薄的纖維帽和富含脂質(zhì)壞死核心、斑塊內(nèi)出血、活動(dòng)性炎癥及鈣化為特征[3]，具有偏心性分布、不規(guī)則表面、糜爛、潰瘍等特征。研究表明約有2/3的腦血管事件是由易損斑塊的破裂造成的[4]。因此，研究易損斑塊的形成機(jī)制對(duì)缺血性卒中的防治尤為重要。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)又稱明膠酶A，它表達(dá)廣泛，能夠降解明膠、膠原和多種基底膜成分，對(duì)于平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移起著重要作用。這些作用可能促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展[5]。基質(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14，MMP-14)是膜型基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，它廣泛存在于基底膜并能降解膠原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和活化MMP-2[6]。相關(guān)研究表明MMP-14在巨噬細(xì)胞豐富的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)豐富[7]。

鑒此，本研究在獲取頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)(CEA)術(shù)后頸動(dòng)脈斑塊組織后，依據(jù)患者術(shù)前相關(guān)影像學(xué)檢查及斑塊組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，將頸動(dòng)脈粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊組與易損斑塊組，運(yùn)用HE染色及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)兩組斑塊中的MMP-2及MMP-14的表達(dá)進(jìn)行分析，探究相關(guān)MMP-2和MMP-14影響易損斑塊發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2018年1月-2019年6月在連云港市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科行CEA的患者55例，其中男50例，女5例。平均年齡(67±6.9)歲。根據(jù)術(shù)前基于頸部血管超聲(carotid doppler ultrasonography，CDU)的多模式影像學(xué)檢查、術(shù)后斑塊HE染色特征將斑塊組織分為穩(wěn)定斑塊組23例，易損斑塊組32例。

CEA納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)北美癥狀性頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除試驗(yàn)(NASCET)標(biāo)準(zhǔn)[8]，(1)中度狹窄(狹窄程度大于50%)且有癥狀患者；(2)重度狹窄(狹窄程度70%～99%)但無癥狀患者。

CEA排除標(biāo)準(zhǔn)：出血性腦血管疾病、風(fēng)濕性心臟病、房顫等引起的頸動(dòng)脈狹窄；放射性頸動(dòng)脈狹窄，病變位置超過第二頸椎；嚴(yán)重肝腎功能不良無法耐受手術(shù)等患者。

斑塊組織收集后進(jìn)行石蠟包埋，以便后續(xù)病理學(xué)免疫組化檢測(cè)。研究對(duì)象術(shù)前均簽署知情同意書。

1.1.2 分組標(biāo)準(zhǔn) CDU評(píng)估易損斑塊標(biāo)準(zhǔn)：斑塊內(nèi)部存在大片低回聲、伴或不伴有斑塊形態(tài)不規(guī)則或纖維帽不完整、斑塊內(nèi)見血流信號(hào)(潰瘍型斑塊)、斑塊內(nèi)出血。CDU評(píng)估穩(wěn)定斑塊標(biāo)準(zhǔn)：斑塊呈中等均質(zhì)回聲，斑塊形態(tài)規(guī)則、纖維帽完整或斑塊呈均質(zhì)中等回聲或強(qiáng)回聲。

病理學(xué)評(píng)估易損斑塊標(biāo)準(zhǔn)[9]：主要標(biāo)準(zhǔn)(1)活動(dòng)性炎癥(單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞有時(shí)伴T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn))；(2)薄纖維帽(厚度<65 μm)伴大的脂質(zhì)核心(脂質(zhì)成分>40%)；(3)血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落伴表面有血小板聚集；(4)存在裂隙或受損傷的斑塊；(5)血管嚴(yán)重狹窄>90%。次要標(biāo)準(zhǔn)：(1)斑塊表面結(jié)節(jié)性鈣化，(2)內(nèi)鏡下黃色反光；(3)斑塊內(nèi)出血及新生血管形成；(4)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙；(5)血管擴(kuò)張性(正性)重構(gòu)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 CEA術(shù)后斑塊進(jìn)行多節(jié)段切面觀察粥樣斑塊形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，然后用4%多聚甲醛溶液固定，脫鈣、脫水后石蠟包埋，以5 μm層厚進(jìn)行組織切片HE染色，觀察斑塊纖維帽、脂質(zhì)壞死核心、出血、鈣化等。

2.4 兩組AECOPD患者肺功能檢查結(jié)果 兩組AECOPD 患 者 肺 功 能 比 較 ，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC、FEV1%均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，患者病情與FEV1/FVC、FEV1%呈負(fù)相關(guān)，見表4。

1.2.2 免疫組化 免疫組化檢測(cè)穩(wěn)定及易損斑塊組織中MMP-2及MMP-14蛋白的表達(dá)。斑塊組織先放入10%福爾馬林溶液中，然后石蠟包埋，以5 μm層厚連續(xù)切片。(1)切片脫蠟水化：將切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，取出后置于100%無水乙醇溶液中浸泡3 min，然后依次浸入70%～90%的各級(jí)酒精中3 min，最好用PBS溶液沖洗切片3次，每次3 min；(2)參照一抗說明書進(jìn)行抗原修復(fù)；(3)配制DAB工作液：按每毫升B液(DAB稀釋液)加入1滴C液(DAB原液)的比例配制工作液，避光保存；(4)實(shí)驗(yàn)步驟：①抗原修復(fù)后待切片自然冷卻，用PBS溶液沖洗切片三次，每次3 min；②將擦拭干凈的切片置于濕盒中，滴入3%的過氧化氫進(jìn)行阻斷，然后避光孵育10 min后，用PBS溶液沖洗切片三次，每次3 min，最后將切片擦拭干凈；③滴加100 μL一抗工作液于切片中，孵育60 min后，用PBS溶液沖洗切片3次，每次3 min，并將切片擦拭干凈；④滴加100 μL A工作液，孵育30 min，并用PBS溶液沖洗切3次，每次3 min，將切片擦拭干凈；⑤加入準(zhǔn)備好的DAB工作液100 L，孵育切片10 min后，用蒸餾水沖洗，在光鏡下控制顯色效果，必要時(shí)用蘇木精復(fù)染；⑥用各級(jí)酒精(70%～100%)脫水、每級(jí)3 min，然后置于二甲苯中，最后封片觀察。

2 結(jié) 果

2.1 患者相關(guān)危險(xiǎn)因素統(tǒng)計(jì) 納入分析患者的年齡、性別、一過性黑蒙、短暫性腦缺血發(fā)作、卒中史、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙史、他汀類藥物服用史、血管狹窄率等臨床數(shù)據(jù)(見表1)。表中顯示，易損斑塊的發(fā)生與性別具有相關(guān)性，男性相較于女性更容易發(fā)展成易損斑塊。同時(shí)具有易損斑塊的患者相較于具有穩(wěn)定斑塊的患者更容易發(fā)生TIA。其他臨床特征和危險(xiǎn)因素在兩組斑塊中的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 患者一般情況及相關(guān)危險(xiǎn)因素分析

相關(guān)檢驗(yàn)指標(biāo)的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：高血壓(收縮壓≥160 mmHg)；高脂血癥(總膽固醇≥220 mg/dl)；糖尿病(空腹血糖≥126 mg/dl)；吸煙史(≥15 y)。

2.2 穩(wěn)定斑塊及易損斑塊的CDU和病理學(xué)特征 穩(wěn)定斑塊的CDU及HE染色特征(見圖1)；易損斑塊的CDU及HE染色特征(見圖2)。放大的易損斑塊的局部組織學(xué)特征(見圖3)。

圖3 易損斑塊的組織學(xué)特征 A：可見易損斑塊薄的纖維帽(FC)及較大脂質(zhì)核心(LC)；B：可見易損斑塊內(nèi)豐富的新生血管(NV)

圖2 A：易損斑塊超聲表現(xiàn)為斑塊形態(tài)不規(guī)則，纖維帽不完整，斑塊內(nèi)可見血流信號(hào)(藍(lán)色箭頭所示)，呈混合不均質(zhì)回聲。B：易損斑塊病理(HE×10)：斑塊纖維帽破裂不連續(xù)、其內(nèi)可見血栓、新生血管、脂質(zhì)核心及較多炎性細(xì)胞

圖1 A：穩(wěn)定斑塊超聲表現(xiàn)為斑塊表面光滑，纖維帽完整；B：穩(wěn)定斑塊病理(HE×10)：斑塊纖維帽完整連續(xù)、表面光滑，其內(nèi)纖維成分居多

表2 MMP-2在穩(wěn)定和易損斑塊組中染色程度的統(tǒng)計(jì)分析

表3 MMP-14在穩(wěn)定和易損斑塊組中染色程度的統(tǒng)計(jì)分析

圖4 MMP-2，MMP-14在穩(wěn)定斑塊組及易損斑塊組的免疫組化結(jié)果比較(圖中箭頭表示染色集聚區(qū)域)

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中發(fā)生發(fā)展的重要病理和臨床基礎(chǔ)，研究表明，頸動(dòng)脈粥樣斑塊尤其是易損斑塊與缺血性卒中密切相關(guān)[10]。我們研究并收集CEA術(shù)后的頸動(dòng)脈斑塊組織，根據(jù)患者術(shù)前相關(guān)影像學(xué)表現(xiàn)及病理特征分為穩(wěn)定斑塊組、易損斑塊組，穩(wěn)定斑塊一般具備脂核小、纖維帽厚、炎癥反應(yīng)輕等特點(diǎn)，不易形成急性缺血事件；易損斑塊具有纖維帽薄，脂質(zhì)核心大及炎癥細(xì)胞豐富的特點(diǎn)，易損斑塊破裂的概率高，因此形成血栓栓塞的危險(xiǎn)性也高[11，12]。

越來越多的證據(jù)表明MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)導(dǎo)致斑塊破裂的重要影響因子[13]。依據(jù)他們的結(jié)構(gòu)和底物特異性，MMPs分為5類：(1)間質(zhì)膠原酶：MMP-1、8、13、18，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原纖維；(2)明膠酶：MMP-2、MMP-9，主要降解彈性蛋白酶及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原纖維；(3)間質(zhì)溶解素：MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12，可降解大多數(shù)ECM 的主要成分，包括蛋白多糖、層粘連蛋白等；(4)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-MMP-17、MMP-24、MMP-25，能夠直接降解多種ECM 成分并激活其它MMPs，由于其分布在細(xì)胞膜表面，所以被認(rèn)為在細(xì)胞遷移中發(fā)揮著重要作用；(5)其他MMPs[14]。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)兩組斑塊組織中的相關(guān)因子進(jìn)行定位分析。我們對(duì)斑塊進(jìn)行連續(xù)組織切片研究MMP-2，MMP-14蛋白在穩(wěn)定和易損斑塊組中的分布。結(jié)果顯示：兩組頸動(dòng)脈斑塊在不同強(qiáng)度下均被MMP-2和MMP-14染色。與穩(wěn)定的斑塊相比，其在易損斑塊組中的染色更明顯更強(qiáng)烈，且在潰瘍型斑塊，斑塊纖維帽破裂等處分布水平較高，而巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞主要分布在斑塊破裂的部位。以上結(jié)果均表明：MMP-2、MMP-14的過表達(dá)可能參與了斑塊的進(jìn)展與破裂過程。

MMP-2是明膠酶的一種，其可由中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞合成并以無活性的酶原形式分泌，MMP-2在體內(nèi)通過纖溶酶等酶的水解而活化，其作用底物包括Ⅳ型膠原纖維等，這些膠原纖維是粥樣斑塊基底膜和纖維帽的重要組成部分。已有研究證實(shí)，MMP-2的過度表達(dá)在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。MMP-2通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分、增大內(nèi)膜面積及細(xì)胞核密度等方式，為斑塊的發(fā)展提供必要空間，當(dāng)這種過程持續(xù)發(fā)展無法阻止時(shí)，可誘發(fā)斑塊破裂[15]。已有研究表明，MMP-2在動(dòng)脈粥樣斑塊以及基底部的血管內(nèi)中膜、粥樣硬化破裂處的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞集聚處顯著表達(dá)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在易損斑塊組的表達(dá)要顯著高于穩(wěn)定斑塊組，且在易損斑塊的破裂區(qū)域表達(dá)豐富，這同時(shí)也是巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞等炎性細(xì)胞集聚的部位。以上現(xiàn)象表明斑塊內(nèi)MMP-2的過度表達(dá)與斑塊的穩(wěn)定性存在明顯的相關(guān)性，MMP-2是形成不穩(wěn)定性斑塊的一個(gè)重要促進(jìn)因素。

最近研究表明，MMP-14通過調(diào)節(jié)ECM環(huán)境，在血管損害、血管壁的細(xì)胞遷移、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、新生血管生成的過程中發(fā)揮著重要作用。對(duì)小鼠的骨髓移植研究證明巨噬細(xì)胞來源的MMP-14在斑塊的穩(wěn)定機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)作為一種膜型金屬基質(zhì)蛋白酶，MMP-14的表達(dá)水平同時(shí)影響MMP-2的活化與表達(dá)[17]。通過免疫組化結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)MMP-14的分布區(qū)域與MMP-2是一致的，但MMP-14在斑塊的分布則主要粘附于巨噬細(xì)胞表面，這也說明了MMP-14作為MMP-2的膜活化分子，對(duì)MMP-2在斑塊內(nèi)的表達(dá)起著信號(hào)傳遞的作用。總之，MMP-14不僅作為蛋白酶而且是一種信號(hào)分子影響著細(xì)胞的病理生理功能[18]。

綜上所述，MMP-2和MMP-14在頸動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)水平與頸動(dòng)脈易損斑塊存在顯著相關(guān)性，是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因子。本實(shí)驗(yàn)研究只進(jìn)行了體內(nèi)斑塊的表達(dá)研究，缺乏對(duì)斑塊進(jìn)展的動(dòng)態(tài)研究，具有一定的局限性。未來可在體外進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞水平及動(dòng)物模型研究，以便更加深入地進(jìn)行相關(guān)因子的干擾調(diào)控或者信號(hào)通路的研究，從而為預(yù)測(cè)及治療易損斑塊尋找更為有效的方法。