在線固相萃取/高分辨質(zhì)譜快速分析三文魚中氧氟沙星殘留量

祝偉霞， 楊冀州， 魏 蔚， 王新輝， 張淑霞

(鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州450003)

氧氟沙星（ofloxacin）是第二代氟喹諾酮類藥物，對革蘭氏陰性/陽性菌具有抗菌活性，主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的防治[1]。氧氟沙星易在動物體內(nèi)殘留，長期食用含有該藥物殘留的食品，可危害人類健康[2]。三文魚以其獨特的口味、豐富的營養(yǎng)，受到越來越多人的青睞。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，目前全球超過70%三文魚來自于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3]。為保障人類身體健康，2015年我國農(nóng)業(yè)部第2292號公告禁止氧氟沙星用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中。我國是三文魚的主要進口國家，為保障國內(nèi)水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，急需建立三文魚中氧氟沙星殘留量的分析方法。

目前有關(guān)氧氟沙星的研究報道主要采用拉曼光譜法[4]、電化學(xué)法[5]、毛細管電泳法[6]、液相色譜法[7-10]和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[11]。水產(chǎn)品中氧氟沙星殘留測定需要液液萃取與離線固相萃取前處理方法[8-9]，操作繁瑣，目前未見有關(guān)三文魚中氧氟沙星殘留量全自動分析的文獻報道。為了提高分析效率，本方法設(shè)計了一種在線固相萃取凈化方法，可以快速測定三文魚中氧氟沙星的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

TranscendTM在線凈化液相色譜聯(lián)合四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；T18渦旋混勻器(德國IKA公司)；3-16KL型離心機（日本Sigma公司）；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；氧氟沙星標準品 (CAS 82419-36-1) 購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(96%)和乙腈(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 標準溶液的準備

稱取氧氟沙星標準品10 mg加入甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，該標準溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，該溶液于-18 ℃以下保存，可穩(wěn)定6個月。取上述標準溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL中間標準溶液，2 ℃～4 ℃保存，可穩(wěn)定1個月。用水-乙腈（9:1）將中間標準溶液稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 儀器參數(shù)

在線固相萃取凈化色譜柱為CycloneTM(50 mm×0.5 mm)；進樣體積為50 μL；液相分離色譜柱為SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ(150 mm×2.0 mm,3.0 μm)；進樣量為50 μL，TurboFlow上樣泵流動相、HPLC流動相、其它儀器條件見表1。

表1 測定氧氟沙星oneline-SPE凈化和色譜條件Table 1 Online -SPE conditions and HPLC parameters of Ofloxacin

檢測器：四極桿-靜電場軌道阱；離子化：正離子電噴霧（ESI+）；離子源溫度：300 ℃；毛細管溫度：350℃；噴霧電壓：3400 V；鞘氣：45 psi；輔助氣：15 psi；質(zhì)量掃描范圍：m/z 200 amu～400 amu；監(jiān)測模式：全自動觸發(fā)二級掃描(dd-MS2)；母離子掃描分辨率為70000，子離子分辨率和閾值為17500和100000；碰撞能量為35 eV；氧氟沙星理論分子量365.1516，檢測分子量362.1511，質(zhì)量精度1.4 ppm，特征子離子318.1612和261.1034。

1.4 樣品前處理

準確稱取1.0 g勻質(zhì)樣品，加入4 mL乙腈混勻，超聲提取10 min，4000 r/min離心2 min，取上清液氮吹至干燥，1 mL乙腈-水（9:1）溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，上機測定。

2 結(jié)果討論

2.1 在線固相萃取條件的優(yōu)化

氧氟沙星屬中等極性的疏水物質(zhì)，SPE方法常主要采用反相固相萃取和陽離子固相萃取柱凈化。Turboflow技術(shù)是基于渦流色譜原理的樣品制備方法，結(jié)合了擴散、化學(xué)吸附和體積排阻原理，在捕獲目標化合物的同時快速除去復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)及核酸等大分子物質(zhì)，并消除基質(zhì)干擾。實驗采用不同在線固相萃取柱Cyclone（1×50 mm）、Cyclone-P（1×50 mm）和HTLC-C18（1×50 mm）進行了對比，發(fā)現(xiàn)Cyclone（1×50 mm）柱對分析物的保留作用最強，實驗選擇Cyclone（1×50 mm）柱為萃取柱。

實驗分別試驗了0.1%甲酸、水和0.1%氨水作為上樣溶劑的效果。結(jié)果表明水為上樣溶劑時，氧氟沙星保留最高，0.1%甲酸和0.1%氨水為上樣溶劑時，分析物在固相萃取柱上的相對保留降低21.7%～46.2%。

實驗比較了不同比例乙腈-0.1%甲酸溶液的洗脫效果。結(jié)果表明采用乙腈-0.1%甲酸（6:4）為洗脫溶劑，氧氟沙星回收率95.7%（見圖1），當乙腈比例增加至100%，回收率無顯著變化?？紤]到目標物在分析柱柱頭的聚焦，實驗選擇較低比例有機相，乙腈-0.1%甲酸（6:4）洗脫溶劑分析物可得到良好的峰形。

2.2 方法驗證

方法采用不含氧氟沙星殘留的三文魚樣品添加3種濃度水平進行檢測，測得方法的最低檢出濃度，經(jīng)實驗方法定量限為2.0 μg/kg。試驗在三文魚樣品基質(zhì)中添加3種濃度范圍的標準溶液，測得線性范圍1.0 μg/kg～100 μg/kg線性范圍內(nèi)，分析物的濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系Y=8472X+1234(R=0.9994)。

試驗選取陰性三文魚分別在定量限、2倍定量限和5倍定量限濃度水平進行加標回收試驗，每個濃度水平平行測定10次，方法回收率為68.7%～102.4%，相對標準偏差在6.7%～12.8%之間。

2.3 實際樣品的測定

為驗證該方法的有效性，收集了48份三文魚樣品進行分析。按照上述方法操作，根據(jù)保留時間和高分辨精確分子量進行確證，未檢出氧氟沙星殘留。本方法的分析結(jié)果與現(xiàn)行國家標準方法分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

該方法聯(lián)合采用在線固相萃取凈化與液相色譜-四極桿/高分辨靜電場串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了三文魚中氧氟沙星殘留的鑒定方法，依靠高分辨精確母離子和二級精確子離子進行定性和定量，測定結(jié)果準確度誤差小于5 ppm。經(jīng)采用實際樣品進行分析，證明本方法分析速度快，準確度高，可用于三文魚中氧氟沙星的快速測定和確證。