定向冷凍明膠支架的原位細菌纖維素培養及支架中的細胞行為

江 雨，吳擢彤，王寶秀，王華平，李 喆

(東華大學材料科學與工程學院，纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620)

將生命科學與工程學的原理和方法相結合，設計并開發出人體損傷組織和器官的臨床替代物，這就是組織工程[1]。組織工程的概念被正式提出后引起了廣泛關注，近些年更是取得了飛速發展，現在已經可以構建多種人體組織，但其進一步發展仍然面臨著多種問題，如種子細胞的選取、適宜的體外培養條件等，其中尋找一種合適的支架材料一直是研究人員探索的方向之一[2]。

組織工程支架的設計理念是盡可能模擬人體天然細胞生長的環境。研究表明，天然組織經脫細胞處理得到的細胞外基質(ECM)是由納米纖維組裝而成的微米級多孔網絡，這種微/納結構不僅能支持細胞的遷移、增殖和組織的長入，而且可以促進細胞的粘附與蛋白表達[3-5]。尤其是材料表面的微/納米定向結構對細胞行為和功能表達都有顯著影響。這種具有表面微/納米定向結構的支架在軟骨、心肌、神經組織工程等領域都有著廣泛的應用[6-7]。現在已經發展出多種設計制備具有定向結構的組織工程支架的方法，如水凝膠技術、溶劑澆鑄技術、靜電紡絲法和快速成型技術等，其中操作簡單，較為常用的是定向冷凍干燥法[8]。在目前已知的天然纖維中，BC的納米網絡形貌與天然ECM最為接近，此外，BC還具有高持水性、良好的生物相容性和優異的力學性能，在組織工程領域有廣泛的應用[9-10]。但由于其結構致密，難以使組織細胞長入。

本文以明膠為原料，采用定向冷凍干燥法制備出定向明膠支架，并通過原位培養技術在支架孔道結構中引入BC納米纖維網絡，構筑出兼具微米多孔和納米纖維結構的BC基微/納支架，并對支架的微觀結構進行表征，探究這種定向結構對細胞行為的影響。

1 試 驗

1.1 原料和試劑

明膠、乙醇、戊二醛均為分析純，購自國藥集團；磷酸鹽緩沖溶液、Live/Dead試劑盒，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚均為生化試劑，均購自Life Technologies有限公司；超純水，自制。

1.2 儀器設備

場發射掃描電鏡，HitachiS-4800型，日本日立；激光共聚焦顯微鏡，TCS SP5Ⅱ型，德國Leica公司；酶標儀，Flexstation3型，美國MD公司。

1.3 定向G/BC支架的制備

在聚四氟乙烯的容器中放入一個直徑為10 cm的金屬銅塊，銅塊上放置三個直徑為3 cm的聚四氟乙烯套管，套管外層用聚苯乙烯的泡沫包覆，進行隔熱處理，搭建成簡易的定向冷凍裝置。將配制好質量分數為6%的明膠溶液倒入聚四氟乙烯模具中，放入定向冷凍裝置中，加入液氮，冷凍4 h，待其冷凍完全后，轉移至冷凍干燥機中干燥72 h。將干燥好的支架放入質量濃度為2%的戊二醛溶液中浸泡交聯10 min，并用大量超純水清洗，去除支架內殘留的戊二醛，然后將干燥后的明膠模板浸入質量濃度為75%乙醇中，于室溫下消毒1 h，再用木醋桿菌培養液浸泡清洗3次。之后，將明膠模板裁剪成圓片狀，放入尺寸為10 cm×10 cm的方形培養皿中，取初始菌種的密度為5×105cell/mL的發酵培養液40 mL，緩慢滴加到明膠模板上，使菌液被模板均勻吸收，然后將方形培養皿轉移到30 ℃的恒溫培養箱中，靜置培養一周，得到定向G/BC復合支架。利用非定向冷凍的方式制備的樣品作為參照。

1.4 測試與表征

1.4.1 場發射掃描電鏡

采用場發射掃描電鏡對支架的微觀結構和不同復合支架上L929細胞的微觀形態進行觀察。將凍干支架截取2 mm×2 mm×2 mm的試樣進行噴金濺射處理，提高樣品表面導電性，然后用FE-SEM觀察支架的上、下表面以及截面處的微觀形貌。

1.4.2 激光共聚焦

采用鈣黃綠素熒光染料(Calcein-AM)標記支架材料上的活細胞(激發波長為494 nm)，用碘化丙啶標即支架材料上的死細胞(激發波長為528 nm)，然后采用激光共聚焦顯微鏡在相應的激發波長下對支架表面和內部細胞分布進行觀察分析。

1.4.3 酶標儀

采用CCK-8法(WST-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)檢測L929細胞在不同支架材料上的增殖情況，使用酶標儀測定每個孔在450 nm處的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 原位培養法制備定向G/BC支架

在傳統的冷凍干燥法中，不存在溫度梯度，各個方向上冰晶的生長都是一致的，干燥后得到的孔洞結構具有各向同性，不利于細胞生長。本工作采用定向冷凍干燥法對冷凍環境進行了改變，形成某特定方向上的溫度梯度，使得晶核朝指定方向生長，干燥后得到的孔洞結構具有各向異性。

如圖1所示，通過定向冷凍干燥法制備的明膠支架具有均勻的軸向通道和徑向多孔結構，當菌液滴加到支架上時，其均勻的軸向通道可以保證菌種和培養基的快速滲透，而徑向相互連通的孔結構又可以為細菌提供充足的附著點，使細菌黏附在支架內部。將接種完的支架放入恒溫培養箱，其均勻的軸向通道與相互連通的孔結構有利于氧氣和營養物質的輸送，為木醋桿菌提供良好的生長條件，使木醋桿菌可以持續合成細菌纖維素，最終成功制備出具有定向結構的支架材料。

這種定向結構同樣可以為細胞生長提供充足的氧氣、營養物質和粘附點，能有效促進細胞的增殖和生長[11-12]。

圖1 原位培養法制備定向G/BC支架的示意圖

2.2 定向G/BC支架的各項表征及其細胞行為分析

2.2.1 原位培養前后不同明膠支架的顯微分析

在掃描電鏡下對原位培養前的明膠支架進行觀察，結果如圖2所示。從圖2(a)和(b)中可以看到，非定向明膠支架為均勻多孔結構，孔徑大小在 100～300 μm范圍內，符合組織工程支架的基本要求。從圖2(c)和(d)中可以看到，定向明膠支架的表面為多孔結構，截面為通道結構，呈現出明顯的各向異性。這是因為在傳統的冷凍干燥法中，不存在溫度梯度，各個方向上冰晶的生長都是一致的，干燥后得到的孔洞結構具有各向同性，而定向冷凍干燥法對冷凍環境進行了改變，形成某特定方向上的溫度梯度，使得晶核朝指定方向生長，干燥后得到的孔洞結構具有各向異性。

圖2 原位培養前不同明膠支架的FE-SEM圖(a)和(b)分別為非定向明膠支架的表面和截面；(c)和(d)分別為定向明膠支架的表面和截面，標尺為200 μm

在掃描電鏡下對原位培養7天后的G/BC復合支架進行觀察，結果如圖3所示。從圖3(a)和(b)中可以看到，非定向G/BC支架內的BC納米纖維主要集中分布在孔洞內壁上，這是由于BC上的羥基可以與明膠支架上氨基形成氫鍵，從而提高BC納米纖維在明膠支架表面的粘附性，但因為支架的連通性較差，BC長入的深度也較淺[13]。從圖3(c)和(d)中可以看到，定向G/BC支架除了表面的孔洞外，截面的片層間也分布有BC納米纖維，這是因為定向支架具有徑向多孔和軸向通道結構，這種各向異性的結構一方面能夠給木醋桿菌提供豐富的吸附位點，另一方面還可以為木醋桿菌的生物發酵提供充足的氧氣和營養物質運輸通道，有利于它的生長、遷移和繁衍，從而促進BC的長入。

圖3 原位培養后不同G/BC復合支架的FE-SEM圖(a)和(b)分別為非定向G/BC支架的表面和截面；(c)和(d)分別為定向G/BC支架的表面和截面，標尺為100 μm

2.2.2 細胞在不同G/BC復合支架的增殖行為分析

通過CCK-8法來探究L929細胞在不同的復合支架上的增殖行為。如圖4所示，L929細胞種植在非定向和定向的G/BC支架上第1、3、5天時的吸光度都是不斷變大的，這說明L929細胞在兩種復合支架上都可以進行正常的增殖行為。將第1、3、5天時各支架的吸光度值進行比較可以得出，非定向和定向的G/BC支架相比存在顯著性差異(p<0.05)。這是由于在定向G/BC支架上BC納米纖維沿著定向冷凍的垂直通道自上而下貫穿整個支架，可以為L929細胞提供豐富的粘附位點，有利于細胞的生長。另一方面，垂直的通道也有利于氧氣和營養物質的輸送，因而細胞在定向G/BC支架上增殖情況要明顯優于非定向G/BC支架。

圖4 L929細胞在不同G/BC復合支架上增殖行為(n=4,p<0.05)

2.2.3 細胞在不同G/BC復合支架的分布及形態分析

為了進一步更加直觀的評價BC納米纖維在支架上分布和支架本身的結構對細胞生長行為的影響，我們采用Live/Dead法分析了L929細胞在非定向(圖5a)和定向(圖5b)的G/BC支架上培養3天后的細胞活力情況。如圖所示，在非定向G/BC支架(圖5a)上的活細胞數量較多，能觀察到少量死細胞，細胞呈現為形態較好的長條形且細胞分布較為均勻，說明細胞在支架上可以較好地分散生長。在定向G/BC支架(圖5b)上的活細胞數量很多，幾乎不存在死細胞，而且可以看出，細胞呈現出較為伸展的形態，說明細胞在定向復合支架上具有極高的細胞活力，這主要是因為定向通道結構有利于氧氣和營養物質的輸送，能有效促進細胞生長。另外，L929細胞在定向G/BC支架上的分布呈現出一維取向，這是由于定向G/BC支架的微觀表面結構呈現出片層狀，而BC納米纖維大量分布在這些片層間，可以為細胞生長提供豐富的粘附位點，在經過三天的培養后，大量細胞在片層與片層間生長，呈現出一維取向的細胞分布。

圖5 L929細胞在不同G/BC復合支架表面上的分布情況(a)為非定向G/BC支架；(b)為定向G/BC支架，標尺為100 μm

本實驗用場發射掃描電鏡來觀察L929細胞在非定向和定向G/BC支架上的生長形態。L929細胞在非定向G/BC支架(圖6a)上呈梭形放射伸展的狀態，其大量的偽足向四周擴散且與支架表面的BC納米纖維緊密粘附形成細胞納米纖維復合物，這種復合物有利于保持L929細胞在材料上的細胞活力，使細胞以舒展的狀態生長。從圖6b中可以看到，L929細胞在定向G/BC支架上會沿著支架片層的方向生長，這一方面是由于片層上存在大量BC納米纖維，納米纖維與細胞間形成的復合物可以提高細胞在支架上的粘附性，另一方面，定向通道結構也可以為細胞生長提供充足的氧氣和營養物質，促進細胞生長，隨著時間的延長，細胞與細胞間緊密相連，呈現梭形伸展的細胞生長形態，并形成細胞層。

圖6 L929細胞在不同G/BC復合支架上培養5天后的細胞形態(a)為非定向G/BC支架；(b)為定向G/BC支架，標尺為10 μm

3 結 論

本文以明膠為原料，采用定向冷凍干燥法制備出定向明膠支架，通過原位培養技術在支架內引入BC納米纖維網絡，構筑出兼具微米多孔和納米纖維結構的BC基定向微/納支架。這種定向支架具有徑向多孔和軸向通道結構，呈現各向異性，有利于氧氣和營養物質的輸送，可以有效促進細胞的增殖與生長，具有良好的生物相容性。