水蓮石斛的組織培養與快速繁殖

莫遠琪 李漢文 江南 鄭楓 房林 李琳 周依清 吳坤林 曾宋君

摘? 要：以水蓮石斛（DendrobiumHibiki）幼嫩假鱗莖為外植體進行組織培養和快速繁殖研究。結果表明：利用75%乙醇結合0.1% HgCl₂，以及適宜程序進行外植體消毒，成功率達92.50%;誘導腋芽的最適培養基為改良MS添加3.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA，腋芽誘導率為91.90%;叢生芽增殖最適培養基為MS培養基添加5.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA，平均增殖系數為2.77;生根壯苗最適培養基為1/2 MS+0.5 mg/L IBA+1.5 g/L活性炭+30 g/L蔗糖+100 g/L土豆泥，生根率100%，生根效果最好;體積比1∶1的植金石與椰殼混合基質適合于移栽，移栽成活率為95.56%。

關鍵詞：水蓮石斛;假鱗莖;快速繁殖;移栽

中圖分類號：Q813.1+2?????文獻標識碼：A

Tissue Culture and Rapid Propagation ofDendrobiumHibiki

MO Yuanqi^{1， 2}， LI Hanwen³， JIANG Nan³， ZHENG Feng²， FANG Lin²， LI Lin²， ZHOU Yiqing²， WU Kunlin²， ZENG Songjun^{2， 4*}

1. Institute of Crop Germplasm Resources， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 2. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China; 3. Dongguan Agricultural Science Research Center， Dongguan， Guangdong 523000， China; 4. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China

Abstract： The young pseudobulbs ofDendrobiumHibiki were taken as the explants for tissue culture and rapid propagation. The results showed that the success rate of explants disinfection reached 92.50% when treating the explants with proper disinfection methodsby 75% alcohol and 0.1% HgCl₂. The modified MS supplemented with 3 mg/L 6-BA and 0.5 mg/L NAA was the most suitable medium for axillary bud induction， in which the induction rate was 91.90%. MS supplemented with 5.0?mg/L 6-BA and 0.5 mg/L NAA was the most suitable medium for the multiplication of clustered shoots， in which the multiplication coefficient was 2.77. 1/2 MS supplemented with 0.5 mg/L IBA， 1.5 g/L activated carbon， 30 g/L sucrose and 100 g/L potato homogenate was the most suitable medium for the rooting and growth， the rooting rate was 100% and growth status of the plantlets was the best. On the mixture of Zhijing stone： coconut husk=1∶1 （V∶V）， the plantlets transplanted grew fastly and the survival percentage was 95.56%.

Keywords： Dendrobium Hibiki; pseudobulbs; proliferation; transplantion

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.016

石斛屬（Dendrobium）是蘭科中第2大屬，全球大約1500～1600個原生種，13 600多個雜交種^[1-4]。石斛屬原生種主要分布于東南亞的熱帶、亞熱帶以及大洋洲^[5]。水蓮石斛（DendrobiumHibiki）是以長苞石斛（D. bracteosum）為母本、雪山石斛（D. laevifolium）為父本雜交獲得的新品種。其株型較小、花型緊湊，冬天老莖上的葉片掉落，春天出新芽，葉片質地稍硬，莖稈泛淺紫紅，花朵呈紫紅色，常盛開在老莖上，與葉片交相輝映，絢麗奪目，花期較長，一般可達40～50?d，且一年中可多次開花;同時，其易栽培且長速快，適合作為盆栽，是近年來我國花卉市場中較受歡迎的石斛新品種之一，因其花型和水蓮相近，在中國花卉市場上稱為水蓮石斛。我國花卉市場上的水蓮石斛多從中國臺灣引進，價格昂貴。水蓮石斛可采用普通的分株和扦插繁殖，但繁殖周期較長，繁殖速度慢，且容易受到環境的影響;采用種子進行無菌播種會發生性狀分離;只有采用組織培養技術進行優質種苗的快速繁殖，才能滿足市場需求。目前以假鱗莖為外植體，通過組織培養建立快速繁殖及種苗生產體系在石斛蘭雜交種中已廣泛應用，但不同種類所需的最適培養基成分和培養條件存在較大差異^[6]。國內外關于水蓮石斛的組織培養快速繁殖技術尚未見報道。本研究以水蓮石斛的幼嫩假鱗莖為外植體進行組織培養與快速繁殖研究，旨在建立其種苗快繁體系，以利于水蓮石斛的應用和推廣，也為其他優良石斛新品種的種苗生產提供參考。

1? 材料與方法

1.1材料

水蓮石斛母株（DendrobiumHibiki）（圖1A）由廣州華大錦蘭花卉有限公司提供，引種于中國臺灣，栽培于華南植物園科研區溫室內（溫度15～32?℃，濕度50%～90%，常規管理），取幼嫩的假鱗莖為外植體（圖1B）用于組培實驗。

1.2方法

1.2.1? 培養基和培養條件? 根據實驗目的選擇不同的培養基，添加不同濃度的植物生長調節劑，以MS^[7]、1/2MS（大量元素減半）或改良的MS培養基（包括MS的大量、微量和鐵鹽及B₅維生素：肌醇100?mg/L、煙酸4?mg/L、煙酸吡哆醇4?mg/L、鹽酸硫胺素40 mg/L）為基本培養基。培養室培養條件為光周期12?h/d，光照強度40～ 45?μmol/（m²·s），溫度（25±2）℃，培養周期45 d。

1.2.2 ?外植體的消毒? 在超凈工作臺上，去除假鱗莖多余葉片，用75%乙醇浸泡過的棉花擦拭3次后，于75%乙醇中浸泡30 s;無菌水沖洗3次后置于含有1滴吐溫的0.1% HgCl₂中浸泡6?min，再用無菌水沖洗3次;剝去莖段表面的假鱗片，再次用0.1% HgCl₂浸泡2?min，無菌水沖洗3次獲得消毒的外植體。

1.2.3? 不同培養基對腋芽誘導的影響? 分別取外植體的上、中、下3個節位，接種在MS+3?mg/L 6-BA，改良MS培養基及改良MS+6-BA（1.0、3.0、5.0、7.0?mg/L）上，每個處理10瓶，每瓶接入含一個節位的外植體，重復3次。休眠芽萌動的起始時間以芽體明顯變大為標準，腋芽誘導率=已誘導出芽的外植體數/接種的外植體總數×100%。

1.2.4? 叢生芽的增殖? MS+15%椰汁為基礎培養基，添加0.5 mg/L NAA+6-BA（0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0?mg/L）、TDZ（0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L）、KT（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L）、2，4-D（1.0、2.0、3.0、4.0?mg/L）進行叢生芽的增殖，以不添加任何植物生長調節劑為對照，每處理10瓶（10叢雙芽/瓶），重復3次。生長芽增殖倍數=新增芽數/接種數。

1.2.5? NAA和IBA對生根壯苗的影響? 1/2MS+ 15%椰汁為基礎培養基，添加NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）、IBA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），以不添加植物生長調節劑為對照。每處理10瓶，20株單芽/瓶，重復3次;實驗結束后測量株高、葉片數、根數、根長、鮮重增量并評價其生長狀況。

1.2.6? 活性炭、蔗糖和其他有機添加物對生根壯苗的影響? 以1/2 MS+0.5 mg/L NAA+150 g/L土豆泥為基礎培養基，添加活性炭（0.25、0.5、1.0、1.5 g/L），以不添加活性炭為對照;在蔗糖濃度實驗中，在1/2 MS培養基中加入蔗糖（0、10、20、30、40 g/L），以不含土豆泥及蔗糖為對照。

以1/2?MS+0.5?mg/L NAA+30?g/L蔗糖+1.5?g/L活性炭為基礎培養基，添加椰汁（5%、10%、15%、20%）、香蕉泥（50、100、150、200?g/L）、土豆泥（50、100、150、200 g/L）或蘋果泥（25、50、75、100 g/L）進行壯苗培養，以不添加有機添加物為對照。培養條件及測量方法同上。

1.2.7? 試管苗移栽? 選用蘭石、植金石（日本進口）、泥炭土（德國進口）、水苔、椰殼、松樹皮共6種基質，設置單一基質或不同配比的兩種復合基質共30個處理（表7）。將生長健壯的幼苗（株高約3.5?cm，含4～5片葉，長勢大體一致）移栽到各基質中，每個處理30盆（花盆內徑10?cm，高9?cm，每盆盛裝基質85%），每盆3株，培養于華南植物園溫室內，2個月后觀測其生長狀況。

1.3數據處理

采用SPSS軟件進行數據分析，采用Duncans法進行多重比較。

2? 結果與分析

2.1外植體的消毒及腋芽的誘導

在消毒后接種的40個外植體，污染3個，污染率為7.5%，未污染的外植體均成活并誘導出腋芽，成功率92.5%。預備實驗時發現改良的MS培養基附加3.0?mg/L?6-BA適合于水蓮石斛腋芽的誘導和前期增殖（圖1B）。

以改良MS為基本培養基，測試了6-BA濃度對誘導不定芽及休眠芽起始萌動時間的影響。結果表明（表1）：1.0、3.0、5.0?mg/L的6-BA均能促進腋芽的誘導，其中6-BA濃度為3.0?mg/L時誘導效果最好，對上段、中段、下段外植體腋芽的誘導率分別為24.07%、81.90%、91.90%，均顯著高于對照。當6-BA濃度為7.0 mg/L時，與對照相比，有抑制作用。

從外植體的部位上分析，在供試的5種培養基上，均以假鱗莖下段為外植體的腋芽誘導率最高，中段次之，上段最低。從腋芽起始萌動時間上看，下段的腋芽起始萌動時間最短，為11～16?d;中段次之，為11～17?d;上段最長，為20～22?d。綜合分析腋芽的誘導率和起始萌動時間可知，水蓮石斛腋芽誘導的最適宜培養條件是以假鱗莖下段為外植體在改良MS+3.0 mg/L 6-BA培養基上進行培養。

2.2叢生芽的增殖

在研究不同濃度植物生長調節劑NAA、6-BA、2，4-D、TDZ、KT對叢生芽增殖效率的影響時發現，在供試的5種植物生長調節劑中，除2，4-D對叢生芽增殖有抑制作用并引起外植體全部死亡外，其余4種均能促進叢生芽增殖。

在一定的濃度范圍內，NAA與6-BA配合使用效果顯著，當NAA的濃度為0.5?mg/L時，在0.5～5.0 mg/L范圍內隨著6-BA濃度的增加，不定芽增殖系數逐步增大，當6-BA濃度為5.0?mg/L時增殖系數達最大值2.77，生長狀況良好，但與添加1.5、2.0、3.0 mg/L 6-BA的培養基無顯著性差異（圖1C）;當6-BA濃度增加到8.0?mg/L及以上時，不定芽增殖系數下降（表2）。單獨添加TDZ及KT對其增殖效果不顯著，而且添加TDZ會導致母株基部畸形膨大。

2.3? NAA、IBA對生根的影響

在1/2 MS培養基上添加或不添加植物生長調節劑NAA、IBA，水蓮石斛均能生根，且生根率達100%，添加NAA、IBA對生根壯苗有顯著影響。與對照相比，在測試的0.5～2.0?mg/L濃度范圍內，NAA、IBA均能刺激生根，植株根數顯著增加，根長縮短，但差異不顯著;其中以0.5?mg/L的NAA、2.0 mg/L的IBA處理根數最多，分別為5.57和5.63。NAA、IBA處理顯著降低株高和增加植株鮮重，表現出明顯的壯苗特征;在測試的0.5～2.0?mg/L濃度范圍內，表現出隨NAA和IBA濃度升高植株株高降低、鮮重增加的趨勢（表3）。

NAA濃度等于或大于1.0?mg/L及IBA濃度等于或大于1.5?mg/L時，個別試管苗出現開花現象（圖1D）。綜合根數、根長、株高、鮮重等參數，0.5?mg/L IBA最適用于水蓮石斛的生根壯苗（表3）。

2.4活性炭、蔗糖和其他有機添加物對生根壯苗的影響

在以1/2 MS+0.5 mg/L NAA+150 g/L土豆泥為基礎培養基，添加不同濃度（0.25、0.50、1.00、1.50?g/L）活性炭的培養基上，從植株長勢來看，添加活性炭的植株生長狀況均優于對照;隨著活性炭濃度的增加，株高、葉片數、根長逐漸增加，但根數和鮮重增量顯著下降，1.50?g/L活性炭對水蓮石斛生長促進作用最佳（表4）。

在1/2 MS培養基中加入不同濃度（0、10、20、30、40 g/L）蔗糖，以不含土豆泥及蔗糖為對照的實驗中，添加蔗糖對生根壯苗促進效果顯著，在不添加蔗糖，添加或不添加150?g/L土豆泥的培養基上，生根率分別為77.74%和72.22%，均顯著低于添加蔗糖的培養基，生長狀況均優于不加蔗糖的對照，因此，在生根培養基中必須添加蔗糖;在分別添加10、20、30?g/L蔗糖時，株高與對照無差異，但葉片數、根數、鮮重增量均顯著高于對照，而添加40?g/L蔗糖時，株高顯著低于對照和其他處理，對生根壯苗具有抑制作用。綜合上述實驗結果，在培養基中添加30?g/L蔗糖對水蓮石斛的生根壯苗效果最好（表5）。

以1/2?MS+0.5?mg/L NAA+30?g/L蔗糖+1.5?g/L活性炭為基礎培養基，添加不同濃度的有機添加物對水蓮石斛生根壯苗有顯著影響。由于培養基中加入了30?g/L蔗糖，生根率均為100%（數據在表6中沒有顯示）。從表6可看出，與對照相比，添加50、75、100?g/L蘋果泥，150、200?g/L香蕉泥，以及200?g/L土豆泥對植株生長有抑制作用，不適于水蓮石斛生根壯苗。添加不同濃度的椰汁時，株高均不同程度降低，葉片數變化不顯著，根長顯著增加;當添加5%、10%濃度椰汁時根數顯著增加，但鮮重增量減少，而20%濃度時鮮重增量顯著。添加50、100?g/L香蕉泥時，株高顯著降低、葉片數稍少，根數和根長、鮮重增量顯著增加。添加50、100、150?g/L土豆泥，植株株高、根長顯著增加，葉片數、根數變化不顯著，添加100?g/L土豆泥時鮮重增量顯著。綜合考慮各參數，添加15%、20%的椰汁、100 g/L香蕉泥或100?g/L土豆泥對生根壯苗促進效果較好，其中添加100 g/L土豆泥效果最佳（圖1E），適用于水蓮石斛的生根壯苗培養。

2.5試管苗的移栽

表7顯示，在供試的6種單一基質中，試管苗的移栽成活率在62.23%～83.34%之間，松樹皮的最低，泥炭土的最高;從生長狀況看，葉寬增加的葉片數比例在17.78%～53.33%，以椰殼為基質時最低，以泥炭土和蘭石的最高;從葉片光澤度看，以泥炭土為基質時的光澤度最好。綜合以上參數，泥炭土是最適于水蓮石斛試管苗移栽的單一基質。在實驗的24個復合基質中，試管苗的移栽成活率在48.89%～100%之間（表7），泥炭土∶松樹皮=1∶1的存活率最高，為100%，其次分別為植金石∶椰殼=1∶1（成活率95.56%）和植金石∶泥炭土=1∶1（成活率95.55%）。從生長狀況看，葉寬增加的葉片數比例最高的是植金石∶泥炭土=1∶1（66.67%的葉寬增加），其次依次為泥炭土∶松樹皮=1∶1（64.44%的葉寬增加），植金石∶泥炭土=1∶2（48.89%的葉寬增加）;從葉片光澤度上看，表現最好的前3種基質分別為植金石∶椰殼=1∶1，植金石∶泥炭土=1∶1和泥炭土∶松樹皮=1∶1。綜合以上參數，適于水蓮石斛試管苗移栽的復合基質為：泥炭土∶松樹皮= 1∶1、植金石∶泥炭土=1∶1（圖1F）及植金石∶椰殼=1∶1。

3? 討論

3.1不同基本培養基對水蓮石斛腋芽生長的影響

石斛組織培養常用基本培養基有MS、1/2MS、2MS、KC^[8]、1/2KC、VW、B₅^[9]、N₆^[10]、Phytotechnology、Mitra、改良RM^[11]等，其中，使用較多的是MS（67%）、1/2MS、KC、VW^[6]。本研究結果顯示，改良MS培養基（含有B₅培養基維生素，維生素含量較高）比MS培養基更適于水蓮石斛腋芽的誘導。

組織培養中添加硫胺素（VB₁），煙酸（VB₃）及煙酸吡哆醇（VB₆）、氨基酸等有益于細胞生長^[12]。比較多種培養基對石斛芽誘導及增殖時，周俊輝等^[13]、楊聯河等^[14]、劉驊等^[15]等均發現B₅優于其他基本培養基。周華偉等^[16]也報道2.0?mg/L煙酸能促進石斛蘭試管苗的生長。在以水蓮石斛假鱗莖為外植體誘導腋芽時，由于改良MS培養基中維生素的含量遠遠大于MS培養基中的量，所以在添加同一植物生長調節劑的條件下，高維生素含量的改良MS培養基比MS培養基在腋芽的誘導速率上有明顯優勢，說明維生素對叢生芽的誘導有促進作用，本研究結果與周華偉等^[16]在石斛蘭組織培養中的結果相似。

3.2不同植物生長調節劑對水蓮石斛增殖、生根的影響

傅玉蘭等^[17]發現3.0 mg/L KT、0.2 mg/L 2，4-D能促進霍山石斛試管苗生長和繼代增殖。石蘭英等^[18]在含1.0 mg/L 6-BA及0.1 mg/L NAA的MS培養基中添加較低濃度的TDZ能使石斛蘭幼芽基部膨大并分化成芽。水蓮石斛叢生芽增殖過程中加入不同濃度的TDZ會導致水蓮石斛植株畸形，而在培養基加入1.0～4.0 mg/L 2，4-D時，外植體全部死亡，說明不同種類的石斛對植物生長調節劑的要求存在差異。在培養基中加入2，4-D時導致植株死亡，可能是由于2，4-D雖具有激素活性，但也具毒性^[19]，其氯代謝中間產物可使植物突變或生長畸形^[20]，本研究結果與盧文蕓^[21]的報道相似。

生長素用于誘導細胞的分裂和分化，但若使用濃度過高則會產生乙烯而導致抑制效果^[13]。杜啟蘭^[22]報道，石斛蘭增殖培養適宜的6-BA和NAA濃度均為0.5 mg/L，根誘導以1.0～2.0?mg/L IAA較好。石瑋等^[23]在研究0.2～2.0 mg/L NAA以及0.1～1.5?mg/L IBA對霍山石斛試管苗生根影響時發現二者具有相同的效應，低濃度的生長素促進生根，高濃度則抑制生根及苗的發育，0.2?mg/L NAA或0.1 mg/L IBA有利于霍山石斛生根。本研究表明，在不添加任何植物生長調節劑的1/2 MS基本培養基中，水蓮石斛能正常生根，添加一定濃度的生長調節劑后其根數增多，但株高及葉片數在一定程度上降低，其伸長生長受到抑制，推測水蓮石斛在生根培養時，幼芽中可能具有較高濃度的內源激素所引起，這個結論與黃肇宇等^[24]、石瑋等^[23]的報道一致。

高磷低氮能夠刺激蘭花試管開花^[25-26]，馮瑩^[27]在單莖型雜種蘭花花芽誘導和發育的研究中發現添加6-BA可促使石斛蘭的花芽發育成熟并開花，Sim等^[28-29]也發現相似的研究結果。水蓮石斛生根過程中，以MS為基本培養基添加15%椰汁、0.5 mg/L NAA以及不同濃度6-BA，隨著6-BA濃度的增加，少量植株有試管內開花現象。推測水蓮石斛的試管開花可能與培養基的高磷低氮以及添加6-BA和椰子汁有關，此結果與李璐^[30]的報道一致，但有關水蓮石斛的試管開花機制有待深入研究。

3.3活性炭及不同有機添加物對水蓮石斛壯苗的影響

培養基中富含氨基酸、植物生長調節劑和維生素的天然復合物可促進愈傷組織和器官的生長。在石斛屬的組織培養中，已報道的有機添加物有椰子汁、香蕉泥、土豆泥、蘋果泥、西瓜汁、白蘿卜汁、殼聚糖、極可善、海藻等^[31-33]。本研究試驗了椰汁、蘋果泥、香蕉泥、土豆泥的壯苗效果，結果表明以1/2 MS為培養基時，添加100?g/L土豆泥適用于水蓮石斛的生根壯苗培養。

活性炭具有吸附作用，在植物組織培養中，添加一定量的活性炭可吸附植物分泌的有害物質，以解決培養過程中的褐化問題，但由于活性炭對物質的選擇性不高，吸附有害物質的同時也能吸附某些植物生長必需的營養成分，包括植物生長調節劑，因此，活性炭的添加量因植物種類而異^[34-35]。本研究發現添加1.5 g/L活性炭對水蓮石斛的生根壯苗促進效果最佳。

3.4水蓮石斛移栽過程中基質的選擇

水蓮石斛的生長勢較弱，采用單一基質時，移栽成活率較低，因此本研究進行了大量的移栽基質實驗。研究的6種單一基質各有特點，植金石、蘭石持水性透氣性好，但營養成分較低;水苔持水能力、透氣性較好，但容重不足;椰殼保水性好，但其鹽分過高，浸泡后具有較高的電導率，對植物根系傷害較大且不利于作物對營養成分的吸收;松樹皮透氣性好但持水性不高;進口泥炭土營養成分及保水能力較高，但價格較為昂貴且通氣性較差，栽培過程中較難管理。本研究中采用松樹皮移栽成活率較低的原因可能與其持水性較差有關，其他基質也存在著一些缺點。根據各種基質的優缺點，將單一組合成混合基質能有效地解決這些問題，結合移栽后植株生長狀況來看，泥炭土∶松樹皮=1∶1，植金石∶泥炭土=1∶1，植金石∶椰殼=1∶1較佳，這些混合基質既有較好的保水性，又具有較好的透水性。綜合考慮種植成本，市場上植金石單價10元/L，德國進口泥炭土單價1.5元/L，椰殼單價0.5元/L，松樹皮單價0.4元/L。因此，基質植金石∶泥炭土=1∶1和基質植金石∶椰殼=1∶1兩種混合基質，盡管移栽成活率較高，但由于植金石較貴，適用于少量水蓮石斛盆栽，而泥炭土∶松樹皮= 1∶1成本較低，成活率高，適用于大規模的商業化生產。

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