基于網絡藥理學的吳茱萸抗腫瘤作用機制研究

曾以旺

[摘要] 目的 基于網絡藥理學研究吳茱萸抗腫瘤的作用機制。 方法 采用活性成分篩選、靶點預測技術，結合生物信息學手段，預測吳茱萸抗腫瘤的潛在作用靶點，并進行信號通路分析，從而探討其治療腫瘤的分子機制。 結果 吳茱萸在TCMSP數據中搜索得到30個相應成分，同時利用靶點預測技術共篩選出相關靶點123個。同時在疾病基因數據庫檢索得到21 365個與腫瘤發生、發展有關的已知靶點基因，利用String數據庫和Cytoscape軟件中的網絡拓撲分析共篩選得出關鍵靶點5個。 結論 吳茱萸作為中藥對腫瘤的作用具有多成分、多靶點、協同作用的特點。

[關鍵詞] 吳茱萸;抗腫瘤;網絡藥理學;作用靶點;作用機制

[中圖分類號] R285 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0131-05

Study of anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology

ZENG Yiwang

Department of Pharmacy， Ganzhou People's Hospital， Ganzhou ? 341000， China

[Abstract] Objective To study anti-tumor mechanism of action of Evodia rutaecarpa based on network pharmacology. Methods The potential anti-tumor targets of Evodia rutaecarpa were predicted by active ingredient screening and target prediction technology combined with bioinformatics methods， and the signal pathway analysis was carried out to explore the molecular mechanism of tumor treatment. Results When Evodia rutaecarpa was searched in TCMSP database， 30 corresponding components were found， and 123 related targets were screened by target prediction technology. Meanwhile， 21，365 known target genes related to tumorigenesis and tumor development were retrieved from the disease gene database， and 5 key targets were selected through String database and network topology analysis in the software of Cytoscape. Conclusion As a traditional Chinese medicine， Evodia rutaecarpa has an effect on tumors which is featured multi-component， multi-target and synergistic.

[Key words] Evodia rutaecarpa; Anti-tumor; Network pharmacology; Target of action; Mechanism of action

腫瘤是指機體在各種致瘤因子的作用下，局部組織細胞增生所形成的新生物。近年來， 腫瘤發病率呈高發趨勢，病死率逐年上升，已經嚴重威脅了人類的生命安全。中醫對腫瘤早有記載， 宋代之前將生于體內的腫瘤稱為癥瘕、積聚等。《諸病源候論》記載：“積聚者，由陰陽不和，臟腑虛弱，受于風邪，搏于臟腑之氣所為也”。《景岳全書》提及“脾腎不足及虛弱失調之人，多有積聚之病”。中醫認為腫瘤是正氣不足、臟腑失調而導致氣滯血瘀、痰凝毒聚、毒熱蘊結形成腫塊，名曰“瘤”、“巖”[1]。目前對于腫瘤的治療手段主要有手術、化療、放療等，化療藥物種類繁多，具有良好的治療效果，但毒副作用較大，長期應用后腫瘤細胞易產生耐藥性。中藥是中國傳統醫學的重要組成部分，許多中藥通過多靶點、多途徑、多效應治療腫瘤，同時具有不良反應少、機體耐受性好等優勢，在治療惡性腫瘤方面發揮了重要作用[2]。

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. officinalis（Dode） Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.） Benth. var. bodinieri（Dode） Huang的干燥近成熟果實，性味辛、苦、熱;有小毒;歸肝、脾、胃、腎經;有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效[3]。現代研究表明，吳茱萸能夠抑制腫瘤細胞活性與增殖、阻滯腫瘤細胞的細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞自噬、抑制腫瘤微血管形成與腫瘤遷移[4]，因此吳茱萸常以單方或復方的形式被廣泛用于腫瘤相關疾病，但其具體作用機制尚未闡明。

網絡藥理學是基于系統生物學的原理闡釋疾病發展的過程，進一步利用網絡平衡的整體觀來認識藥物與機體相互作用的一種新興技術，具有“多基因、多靶點”的特點，開創了一種多靶點與多種疾病間復雜網狀關系的新型模式，在復雜疾病發病機制及治療靶標的研究方面具有重要的應用價值[5]。網絡藥理學研究策略具有整體性、系統性的特點，這與中醫藥整體觀與辨證論治的原則相契合[6-7]。因此，構建中藥網絡藥理學動態的藥動學模型，可以從機制方面表征藥物對疾病進展的影響，對分析藥物間相互作用和穩態反饋機制具有重要意義[8]。因此，本文運用網絡藥理學方法，研究吳茱萸抗腫瘤的多成分、多靶點和多通路作用機制，以期為吳茱萸的臨床使用提供依據，現報道如下。

1 相關數據庫與軟件

活性成分及靶點的獲取：TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;靶點對應基因的查找：Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）;疾病靶點的獲取：Genecards數據庫（http：//www.genecards.org/）;關系圖的繪制：Draw Venn網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）;交互網絡構建：Cytoscape3.7.1軟件;通路分析：Metascape數據庫（http：//metascape.org/gp/）及DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）。

2 實驗方法

2.1 吳茱萸活性成分的獲取與篩選

采用TCMSP數據庫（http：//lsp. nwu. edu. cn/tcmsp.php），獲取吳茱萸的化學成分;通過口服利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）對吳茱萸相關活性成分進行篩選，得出吳茱萸目標活性成分。

2.2 活性成分作用靶點的獲取

采用TCMSP數據庫獲得目標成分所對應的作用靶點，并在UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/）中查找作用靶點的相關標準基因，刪掉重復項后得到目標成分對應的基因靶點。

2.3 “目標成分―對應靶點”網絡構建

將上述獲得的成分及靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，建立吳茱萸“成分-靶點”知識網絡，以直觀地研究各成分與靶點之間的關系網絡。

2.4 疾病靶點的獲取

基于Genecards、TTD、Drugbank數據庫和相關文獻獲取與腫瘤相關的靶點。

2.5 吳茱萸抗腫瘤作用靶點的預測

將上述兩步得到的吳茱萸目標活性成分靶點與抗腫瘤相關靶點導入Venn數據庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）進行交互分析，獲得交集靶點，建立吳茱萸目標成分-疾病-靶點的信息網絡。

2.6 蛋白相互作用網絡構建與分析

將交互靶點導入String數據庫（https：//string-db.org/cgi/），只計算物種為Homo sapiens的蛋白相互網絡關系，以節點（node）和邊（edge）表示靶點關聯程度。同時采用Cytoscape 3.7.1軟件對所得結果進行拓撲分析，并運用中位數卡方原則，經“Dgreement”和“Clossment”參數比對確定關鍵靶點[9]。

2.7 富集分析

將關鍵靶點導入FUNRich 6.0軟件，物種限定為Homo sapiens，對關鍵靶點所涉及的細胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）和信號通路（PW），以P值<0.05為閾值，完成關鍵靶點的富集分析。

3 結果

3.1 吳茱萸活性成分的獲取

從TCMSP數據庫中獲取吳茱萸的化學成分，通過篩選符合口服利用度（OB）≥30%以及類藥性（DL）≥0.18的化學成分，并結合ADME分析[10]，篩選得到符合條件的活性成分共計30個，化合物具體信息見表1。

3.2 吳茱萸抗腫瘤的相關靶點信息

將從 TCMSP數據庫并結合文獻挖掘方法收集到的基因進行整理，刪除重復項后共123個相關靶點;采用GeneCards數據庫獲取與腫瘤相關的靶點共21 365個，建立腫瘤疾病靶點庫;將收集到的吳茱萸成分靶點與腫瘤疾病靶點進行交互分析，結果顯示吳茱萸目標成分所對應的123個靶點中有113個與腫瘤有關。見封三圖9、表2。

3.3 PPI分析結果

將交互基因信息導入String數據庫，設置每個靶點要顯示的最大交互程序數不超過50條，獲得蛋白質相互作用網絡構圖（封三圖10），其中節點有113個，邊有1066條，實驗結果解釋吳茱萸抗腫瘤的各個靶點之間聯系緊密。同時采用中位數原則，經“Dgree ment”和“Clossment”參數進行篩選，共得到5個主要的靶點：MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。

3.4 GO分析和KEGG富集分析

采用FUNRich和KORAS數據對交互靶點進行GO分析結果，見圖1。細胞組分（CC）分析數據表明吳茱萸可調節細胞內外空間環境，改變細胞膜表面受體表達能力以及細胞器活動等。分子功能（MF）分析得出吳茱萸可直接影響G蛋白偶聯受體相關活性、配體依賴性核受體相關蛋白、谷胱甘肽轉移酶活性、肽酶活性、細胞外配體門控離子通道活性、細胞因子活性、跨膜受體蛋白活性、催化活性、輔因子結合、電壓門控離子通道活性等多途徑發揮抗腫瘤活性。同時生物途徑（BP）分析得出吳茱萸可影響腫瘤細胞的能量代謝、細胞通訊和信號傳導、核心蛋白代謝等途徑來干預腫瘤細胞增殖。

信號通路分析結果得出（圖2），吳茱萸可直接干預IL-3、IL-5等相關炎癥家族、雷帕霉素（mTOR）、γ-IFN等30條信號通路發揮抗腫瘤活性。這一結果解釋吳茱萸可抑制腫瘤細胞能量代謝通路和炎癥通路，從而阻斷炎癥浸潤的出現;并激活細胞自噬通路，加快腫瘤細胞的凋亡。

4 結論

腫瘤根據其臨床特點，在中醫范疇內被稱為癥瘕、積聚等。腫瘤細胞歸屬于“邪氣”，常見腫瘤患者臨床癥見腫塊、出血、臟器梗阻等。由吳茱萸組成的方劑中最常用的為“左金丸”，出自《丹溪心法》，歷史悠久，臨床應用廣泛，其主要成分小檗堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿等均有良好的抗腫瘤活性，且左金丸在治療胃癌的實驗研究方面取得了一定的研究進展[11]。

本實驗采用網絡藥理學對吳茱萸抗腫瘤成分和作用機制進行系統研究，結合口服利用度（OB）和類藥性（DL）篩選出吳茱萸與抗腫瘤相關的活性成分共30種。利用Cytoscape軟件構建吳茱萸“成分-靶點”網絡，揭示吳茱萸具有多成分、多靶點的作用特點。分子對接結果顯示，涉及123個靶點，其中113個與腫瘤有關，這一結果說明吳茱萸目前具有確切的抗腫瘤作用。結合相關數據庫對吳茱萸抗腫瘤靶點進行分析得出吳茱萸可抑制腫瘤細胞能量代謝過程、DNA轉錄過程和信號傳導過程，激活或抑制與腫瘤細胞有關的30條信號通路來干預腫瘤細胞的擴散和炎癥因子浸潤現象的發生。

將交互基因進行PPI映射并構建網絡，對網絡分析后發現多個與抗腫瘤緊密相關的靶點，其中主要作用靶點為MAPK14、PDE10A、ACACA、EGFR、IL1B。MAPK激酶作為多種生化信號的整合點，可參與細胞增殖、分化、轉錄調控和發育等多種過程[12-14]。其可被各種環境壓力和促炎細胞因子激活。包括轉錄調節因子ATF2、MEF2C和MAX細胞周期調節因子CDC25B和腫瘤抑制因子p53[15]，在轉錄水平調控凋亡相關蛋白，進而誘導凋亡發生，完成抑制腫瘤細胞分裂增殖進而殺死腫瘤細胞的目的。PDE10A是一個已知的用于治療精神類疾病的藥物靶點，其可通過調節腦垂體海馬區活動來調節精神性疾病，也可干預激素的分泌或激活MAPK相關通路以致腫瘤細胞快速增殖[16]。EGFR是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用，可激活MAPK加快腫瘤細胞分化。因此MAPK、EGFR和PDE10A是相互干預、協作的靶點[17]。ACACA是催化長鏈脂肪酸生物合成中的限速反應的一種酶，脂肪酸的合成和代謝對于細胞能量的產生，特別是在糖酵解活性低的腫瘤細胞中具有至關重要的作用。IL1B是一種在生理和病理狀態下均具有多重作用的多效性因子，并且通過生長因子的表達，可推斷為腫瘤發生進展的一個重要靶點。腫瘤微環境中高濃度的IL1B可刺激腫瘤的生長，且產生IL1B的腫瘤患者預后通常較差。

基于以上結果，本研究應用網絡藥理學方法，對吳茱萸抗腫瘤機制進行了初步探討，吳茱萸中每個化合物可調控多個靶點，同一靶點可參與多個信號通路和生物學過程，體現了吳茱萸多成分、多靶點、多途徑的抗腫瘤活性。化合物-靶點-相關疾病網絡中度值較高的靶點，參與多個重要的信號通路和生物學過程，為吳茱萸抗腫瘤的研究與臨床應用提供了科學依據，也為進一步闡明中藥吳茱萸的潛在作用機制奠定了基礎和提供了新思路，但其具體作用機制并不可知，因此后期將對吳茱萸抗腫瘤作用機制進行詳細研究。

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（收稿日期：2020-03-06）