茶多酚對肺炎克雷伯菌抑菌作用的研究

劉五高 張寧 劉愛霞

[摘要] 目的 探討茶多酚對肺炎克雷伯菌的殺菌作用，及其與常用抗菌藥物聯合使用的抑菌療效，并初步探討其作用機制。 方法 采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統對臨床分離的20株肺炎克雷伯菌進行細菌鑒定;K-B法檢測常見藥物亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定的敏感性;瓊脂稀釋法檢測茶多酚的最低抑菌濃度（MIC）;同時檢測0.5 MIC（512 μg/mL）茶多酚與常用抗菌藥物聯合使用后試驗藥物抑菌環直徑的變化，并判斷茶多酚聯合常用抗菌藥物對多重耐藥肺炎克雷伯菌抑制作用的可行性。使用結晶紫染色法、剛果紅染色方法檢測茶多酚對細菌生物膜形成和胞外黏液樣物質（slime）產生的影響。 結果 20株肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物均耐藥，K-B值為6～15 mm;茶多酚對20株多重耐藥肺炎克雷伯菌的MIC均值為1024 μg/mL;與常用試驗藥物聯用：0.5 MIC（512 μg/mL）茶多酚能使亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定的抑菌環直徑增加3～28 mm不等，能明顯與受試抗生素產生顯著的協同作用，并且能逆轉部分試驗藥物從耐藥變為敏感。亞抑菌濃度下茶多酚能顯著抑制肺炎克雷伯菌生物膜和胞外黏液樣物質（slime）的產生。 結論茶多酚與常用抗菌藥物（亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定）聯合使用對多重耐藥肺炎克雷伯菌具有協同殺菌作用，并且影響其細菌生物膜形成和胞外黏液樣物質（slime）的產生。

[關鍵詞] 茶多酚;多重耐藥;肺炎克雷伯菌;聯合藥敏試驗

[中圖分類號] R446.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0044-05

Study on the antibacterial effect of tea polyphenols on Klebsiella pneumoniae

LIU Wugao ? ZHANG Ning ? LIU Aixia ? WU Ningjun ? JIN Jing

Department of Laboratory Medicine， Lishui People's Hospital in Zhejiang Province， Lishui ? 323000， China

[Abstract] Objective To investigate the bactericidal effect of tea polyphenols on Klebsiella pneumoniae and its antibacterial effect in combination with commonly used antibacterial drugs， and to explore its mechanism of action. Methods Bacterial identification of 20 strains of Klebsiella pneumoniae clinically isolated was performed using the VITEK 2 Compact microbiological identification system. K-B method was used to detect the sensitivity of common drugs imipenem， piperacillin/tazobactam， cefepime， cefotaxime， and ceftazidime. Agar dilution method was applied to detect the minimum inhibitory concentration（MIC） of tea polyphenols. The diameter changes of the bacteriostatic ring after the application of 0.5 MIC（512 ?μg/mL） tea polyphenols in combination with commonly used antibacterial drugs was tested. The feasibility of tea polyphenols combined with commonly used antibacterial drugs to inhibit Klebsiella pneumoniae was judged. The effects of tea polyphenols on bacterial biofilm formation and extracellular slime production were examined using crystal violet staining and Congo red staining. Results 20 strains of Klebsiella pneumoniae were resistant to commonly used antibacterials and the K-B value was 6-15 mm. The average MIC value of tea polyphenols to 20 strains of Klebsiella pneumoniae was 1024 μg/mL. Combined with commonly used antibacterial drugs： 0.5MIC（512 μg/mL） tea polyphenols could increase the diameter of bacteriostatic rings of imipenem， piperacillin/tazobactam， cefepime， cefotaxime， and ceftazidime by 3-28 mm， obviously produce a significant synergistic effect with the tested antibiotics， and reverse the change from resistance to sensitivity of some test drugs. Tea polyphenols could significantly inhibit the production of Klebsiella pneumoniae biofilms and extracellular slime-like substances at subinhibitory concentrations. Conclusion Tea polyphenols combined with commonly used antibacterial drugs（imipenem， piperacillin/tazobactam， cefepime， cefotaxime and ceftazidime） has a synergistic bactericidal effect against multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae， and influences the formation of bacterial biofilms and the production of extracellular slime.

[Key words] Tea polyphenols; Multidrug resistance; Klebsiella pneumoniae; Combined drug sensitivity test

肺炎克雷伯菌是導致醫院感染的常見病原菌，研究表明其耐藥性尤其是對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性近年來增長迅速[1]，甚至出現了對黏菌素耐藥的菌株[2]。如何有效治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染已成為臨床上一項重要的課題。茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類物質的總稱[3]。近年來，國內外學者對茶多酚化學、藥理和臨床應用等進行了多方面研究，證實了茶多酚的殺菌力強，抗菌譜廣，具有卓越的功效[4-6]。本研究對茶多酚在抑制多重耐藥肺炎克雷伯菌的療效進行了初步探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料來源

選取20株2017年2～11月我院臨床分離的多重耐藥菌肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC70063（購自美國菌株保藏中心）為研究對象。

1.1.1 儀器 ?比濁儀和VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統購自法國生物梅里埃公司;連續微量加樣器購自美國Eppendorf公司，CO2培養箱購自德國Memmert公司。

1.1.2 試劑 ?MH瓊脂為杭州濱和微生物試劑有限公司產品（批號170607）;哥倫比亞血瓊脂平板為鄭州安圖生物公司產品（批號20171204B）;藥敏紙片為英國OXOID公司產品（批號：CAZ，2256528;CXM，2346194 FEP 2199512;TZP，2217954;IPM2371850）;茶多酚購自大連美侖生物（純度>99.31%），其含有53.9%的EGCG（epigallocatechin gallate）和0.32%咖啡因;肉湯培養基（OXOID，批號2151741）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 ?從已分純培養16～18 h的哥倫比亞血瓊脂平板上挑取2～3個菌落分別移至3 mL生理鹽水，以比濁儀校正濁度至0.5麥氏單位。

1.2.2 茶多酚儲備液的配制 ?茶多酚儲備液為10 mg/mL，將50 mg茶多酚粉末溶解于5 mL 0.15 mM H3PO4中，通過0.22 μm孔徑的膜過濾器過濾制成保存液以避免氧化，使用前保存于為-20℃冰箱。

1.2.3 M-H瓊脂平板和M-H茶多酚平板的配制 ?在90 mm內徑的平板中傾注25 mL的培養基使其厚度為4 mm，配成M-H瓊脂平板。將茶多酚儲備液配于M-H瓊脂平板中，使平板中茶多酚的終濃度分別為2048 μg/mL、1024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL和128 μg/mL，其為M-H茶多酚平板。

1.2.4 不同濃度茶多酚抑菌率曲線測定 ?微孔板生物檢測法：平底96微孔板上取3個微孔作為陰性對照孔（對照孔中加入250 μL 0.15 mM H3PO4），分別加入250 μL培養液。后面每孔內分別加入250 μL 1.5×105 CFU/mL的細菌培養液。留3個微孔作為陽性對照，在之后的微孔中加入4096 μg/mL茶多酚250 μL，使其終濃度為2048 μg/mL，然后從中吸取250 μL混懸液至下一孔，依此類推，使后面微孔中的TP濃度分別為1024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL。于37℃過夜培養，波長600 nm下測定微孔板中各孔內培養液的吸光度（A）值，計算各孔中樣品的抑菌率。抑菌率計算公式如下：抑菌率%=AR-A/AR-AB×100%。式中：AR：菌液陽性孔的吸光值，AB：陰性對照孔的吸光值，A：樣品測定孔的吸光值。分別統計茶多酚的抑菌率。

1.2.5 Kirby-Bauer法藥敏試驗 ?把0.5麥氏單位的受試菌均勻涂布于M-H瓊脂平板，同時在平板上分別貼上亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定，35℃～37℃培養18～24 h后量取抑菌環直徑（mm），平行做兩次，取平均值。結果判斷標準按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）2018年推薦的方法及標準[7]，以敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）報告藥敏試驗結果。

1.2.6 茶多酚的瓊脂稀釋與常規藥敏紙片的聯合檢測 ?在0.5 MIC（512 μg/mL）茶多酚M-H平板上分別接種0.5麥氏單位的受試菌，同時在平板上分別貼上亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定，35～37℃培養18～24 h后量取抑菌環直徑（mm）。平行做兩次，取平均值。

1.2.7 結果判定 ?依據文獻[8]進行判定，將瓊脂稀釋與常規藥敏紙片聯合，檢測抑菌環直徑增加5 mm以上為協同作用，增加3～4 mm為相加作用，<2 mm為無關作用。

1.2.8 茶多酚對肺炎克雷伯菌的作用研究 ?結晶紫染色法測茶多酚對肺炎克雷伯菌生物膜形成的影響，具體方法為：將菌懸液按10%（V/V）接種量接種96孔板中，37℃、180 r/min下振蕩培養24 h，輕輕倒去培養液，用PS緩沖液洗去生物膜表面浮游細菌;加入0.1%結晶紫水溶液200 μL，室溫染色5 min，倒出染色液用去離子水輕輕洗滌2次;45℃烘箱干燥后，加乙醇溶液0.2 mL，洗脫吸附于生物膜上的染料，595 nm處測定吸光值。通過將肺炎接種到含有剛果紅平板上，37℃培養24 h定性檢測茶多酚對胞外黏液樣物質（slime）產生的影響。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 茶多酚對肺炎克雷伯菌ATCC70063抑菌試驗

茶多酚對肺炎克雷伯菌ATCC70063抑菌率隨濃度增加而增大，見圖1。當茶多酚濃度為1024 μg/mL時受試菌被完全抑制，因此，其MIC值在512～2048 μg/mL之間，該處取其均值1024 μg/mL。

2.2 茶多酚的瓊脂稀釋法與常規藥敏紙片的聯合檢測

濃度512 μg/mL的茶多酚瓊脂平板分別和抗生素聯合藥敏檢測（封三圖3），使試驗菌的相應抗生素K-B值明顯增大，依據文獻[8]把抑菌環直徑增加5 mm以上為具協同作用，在肺炎克雷伯菌藥敏試驗中茶多酚對試驗的5種抗生素均有協同作用，能使亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定的抑菌環直徑增加3～28 mm不等，使原本耐藥的抗生素發生逆轉，重新對多重耐藥肺炎克雷伯菌敏感。見表1。

2.3 茶多酚對肺炎克雷伯菌生物膜形成的影響

2.3.1 對肺炎克雷伯菌生物膜形成的影響 ?經SPSS 17.0軟件獨立樣本t檢驗分析，0 μg/mL組與研究各組的生物膜形成均有顯著差異（t值分別為35.700、101.329、94.000，P均<0.001）;200 μg/mL組與其他各組間有顯著性差異（t值分別為23.720、24.502，P均<0.001）;但600 μg/mL組與400 μg/mL組之間無差異（t=-2.673，P=0.060）。表明茶多酚能顯著抑制生物膜的形成，但這種抑制功能在400 μg/mL茶多酚濃度之后并不呈濃度梯度依賴性。茶多酚在400 μg/mL之前肺炎克雷伯菌生物膜形成與濃度梯度有顯著性變化，但之后與茶多酚濃度梯度差異不顯著。見表2。

2.3.2 茶多酚對細菌胞外黏液樣物質（slime）產生的影響 ?通過將細菌接種到含有剛果紅平板上，定性檢測茶多酚對slime形成的影響。經培養20 h后，從平板培養的菌落可以明顯觀察到（封三圖4）在沒加茶多酚的平板上菌落呈黑色，表明肺炎克雷伯菌分泌胞外黏液樣物質（slime），為slime陽性。而加入茶多酚的菌株呈淡粉色無黑色菌落，為slime陰性。表明茶多酚可明顯抑制肺炎克雷伯菌株胞外黏液樣物質（slime）的產生。

3 討論

隨著抗生素的長期和廣泛使用，致使耐藥性致病菌的檢出率不斷增加，這對臨床抗感染治療產生了巨大挑戰。而超級細菌的出現與流行，如碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌已在WHO的全部區域都已檢出[9]，更加重了人們對這一問題的擔憂。

茶多酚已被證明具有廣譜抗菌性能，大量研究表明，茶多酚對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等常見細菌有較強的抑制作用[10-12]。當然，不同細菌對茶多酚的抗性不同，這和茶多酚的具體構成成分以及細菌的特點有關。同時，有研究發現茶多酚與多種抗生素具有協同抗菌作用，如茶多酚與四環素協同能對葡萄球菌有抑菌作用等[13]。而本次研究也發現其能夠加強亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟和頭孢他定對肺炎克雷伯菌的抗菌活性，并且在亞抑菌濃度下（512 μg/mL），能顯著增加抗菌藥物的K-B值，其抑菌環直徑絕大多增加到5 mm以上，提示茶多酚與抗菌藥物聯用存在顯著的協同作用。其中對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢吡肟的協同作用最大，頭孢噻肟和頭孢他定其次。使部分耐藥的受試抗生素逆轉為敏感，并且這種逆轉與細菌本身的耐藥性無顯著相關。目前，茶多酚抗菌機制還未有明確定論，未完全清楚。有些研究認為茶多酚中的EGCG可能直接綁定肽聚糖并促使其沉淀，由于肽聚糖是許多細菌細胞壁的主要成分，所以EGCG可阻礙細菌細胞壁的形成和作用，這種假說被認為是茶多酚的主要抑菌機理[14]。也有理論認為，茶多酚的抗菌作用，主要是通過與活性氧物質反應，產生過氧化氫，從而發揮作用[15]。此外，有研究證實茶多酚可發揮特異性凝固細菌蛋白的作用，從而破壞細菌細胞膜結構，改變細菌生理抑制生長。而本研究揭示了茶多酚對細菌生物膜形成具有明顯抑制作用，但這種抑制功能并不全部是濃度依賴性，大約在0～0.5 MIC與茶多酚濃度呈正相關，0.5 MIC濃度之后其抑制作用明顯變弱。另外，通過茶多酚對細菌胞外黏液樣物質（slime）產生的影響研究，表明茶多酚對肺炎克雷伯菌的毒性因子也具有抑制作用。其機制可能與細菌的群體感應作用有關[16]。茶多酚通過干擾細菌群體感應中信號分子的合成從而影響細菌成膜能力，對細胞膜形成起到了抑制作用，使細胞內外滲透壓失衡，導致細胞破裂甚至死亡[17]。本研究也進一步證實了茶多酚的這種抑制機制。

雖然體外試驗已證實茶多酚對細菌生長具明顯的抑制作用，但由于茶多酚被人體較難吸收利用，其到達靶器官或組織的量相對較低并且代謝速度很快，其藥物濃度遠遠低于實驗所測的MIC值，導致其生物學活性大大降低[18-20]，因此，限制了茶多酚由實驗室向實際應用領域的拓展。在今后的研究中，我們應著力于研究改善茶多酚在機體內的吸收與代謝的相關技術，例如基于納米結構的藥物遞送系統、分子修飾以及茶多酚與其他天然產物協同作用等[21]，使我們能夠更好地評估茶多酚及其代謝物對改善宿主健康的貢獻。

[參考文獻]

[1] 2016年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志，2017，（5）：7-17.

[2] Wang Y，Tian GB，Zhang R，et al. Prevalence，risk factors，outcomes，and molecular epidemiology of mcr-1-positive Enterobacteriaceae in patients and healthy adults from China：An epidemiological and clinical study[J].Lancet Infectious Diseases，2017，17（4）：390.

[3] Pasrija D，Anandharamakrishnan C. Techniques for extraction of green tea polyphenols：A review[J]. Food and Bioprocess Technology，2015，8（5）：935-950.

[4] Hannig C，Sorg J，Bettina Spitzmüller，et al. Polyphenolic beverages reduce initial bacterial adherence to enamel in situ[J]. Journal of Dentistry，2009，37（7）：566.

[5] Hannig C，Bettina Spitzmüller，Al-Ahmad A，et al. Effects of Cistus-tea on bacterial colonization and enzyme activities of the in situ pellicle[J]. Journal of Dentistry，2008，36（7）：0-545.

[6] Li W，Qi XU，Shun XU，et al. Research progress of tea polyphenols on growth of microorganisms[J]. Modern Food Science and Technology，2013，29（7）：1737-1741.

[7] Dalyan Cilo Burcu，Topa? Tuncay，A [g]ca Harun，et al. Comparison of clinical laboratory standards institute（CLSI） and european committee on antimicrobial susceptibility testing （EUCAST） broth microdilution methods for determining the susceptibilities of Candida isolates[J]. Mikrobiyoloji Bulteni，2018，52（1）.

[8] 胡麗慶，孫定河，王盛，等. 大蒜素瓊脂紙片擴散法聯合藥試驗的可行性研究[J]. 中國衛生檢驗雜志，2017，（6）：16-19.

[9] Campos，Anaelís C，Albiero J，et al. Outbreak of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K pneumoniae：A systematic review[J]. American Journal of Infection Control，2016，44（11）：1374-1380.

[10] Sun FL，Chen GN，Wu B，et al. Research on the extraction and antibacterial activity of tea polyphenols[J]. Applied Mechanics and Materials，2014，644-650：5157-5160.

[11] 王瑩. 茶多酚的抗氧化和抑菌活性及其增效劑[J]. 生物學雜志，2007，（5）：56-58.

[12] 董璐，代增英，韓晴，等. 茶多酚對大腸桿菌抑菌機理的研究[J]. 生物學雜志，2015，（1）：72-75.

[13] 華德興，許曉玲，彭青，等. 表兒茶素沒食子酸酯與四環素協同抗金黃色葡萄球菌作用及機制[J]. 中國新藥與臨床雜志，2009，（12）：65-69.

[14] Chan EC，Tie PP，Soh EY，et al. Antioxidant and antibacterial properties of green，black，and herbal teas of Camellia sinensis[J]. Pharmacognosy Research，2011，3（4）：266.

[15] Hamilton-Miller JM. Antimicrobial properties of tea（Camellia sinensis L.）[J]. Antimicrobial Agents & Che-motherapy，1995，39（11）：2375-2377.

[16] Honging Yin，Yifeng Deng，Huafu Wang，et al. Tea polyphenols as an antivirulence compound disrupt quorum-sensing regulated pathogenicity of pseudomonas aeruginosa[J]. Scientific Reports，2015，5（1）：16158.

[17] 黃旭鎮. 大黃魚特定腐敗菌波羅的海希瓦氏菌QS系統的鑒定及茶多酚調控研究[D]. 杭州：浙江工商大學，2015：55-57.

[18] Sun H，Chen Y，Chen M，el al. The modulatory effect of polyphenols from green tea，oolong tea and black tea on human intestinal microbiota in vitro[J]. J Food Science and Technology，2018，55（1）：399-407.

[19] Guo X，Cheng M，Zhang X，et al. Green tea polyphenols reduce obesity in high-fat diet-induced mice by modulating intestinal microbiota composition[J]. International Journal of Food Science & Technology，2017，52（8）：1723-1730.

[20] Xin Zhang，Man Zhang，Chi-Tang Ho，et al. Metagenomics analysis of gut microbiota modulatory effect of green tea polyphenols by high fat diet-induced obesity mice model[J].Journal of Functional Foods，2018，46：268-277.

[21] 周方，歐陽建，黃建安，等. 茶多酚對腸道微生物的調節作用研究進展[J]. 茶葉科學，2019，39（6）：619-630， 616.

（收稿日期：2020-02-21）