中間錦雞兒CiNAC038啟動(dòng)子的克隆及對(duì)激素響應(yīng)分析

紅格日其其格 王燕飛 高仙靈 龐彩霞 尚曉蕊 李國(guó)婧 王瑞剛

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物逆境生理與分子生物學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010011；2. 呼和浩特職業(yè)學(xué)院，呼和浩特 010051）

植物生長(zhǎng)過程中會(huì)遇到干旱、鹽堿、冷等不同環(huán)境脅迫，從而影響其正常發(fā)育及產(chǎn)量。在面臨脅迫時(shí)，植物會(huì)通過一系列的自身應(yīng)對(duì)機(jī)制來適應(yīng)各種逆境。其中之一是轉(zhuǎn)錄因子通過與基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)［1］，或通過一個(gè)或多個(gè)DNA結(jié)合域的模塊結(jié)構(gòu)調(diào)控基因表達(dá)［2］，從而響應(yīng)各種逆境脅迫。

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的、成員數(shù)目較多的一類家族。已在不同物種中發(fā)現(xiàn)并確定了NAC轉(zhuǎn)錄因子成員及數(shù)量，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有117個(gè)、水稻（Oryza sativa）中有151個(gè)、大豆（Glycine max）中有152個(gè)、葡萄（Vitis vinifera）有74個(gè)、木豆（Cajanus cajan）中有88個(gè)、白菜（Brassica pekinensis）中有 204個(gè)NAC基因［3-4］。研究證明，NAC轉(zhuǎn)錄因子是具有多種生物功能的植物特異轉(zhuǎn)錄因子［5］。例如，擬南芥SND1、VND7、NST1（2/3）以及蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtNST1參與植物次生生長(zhǎng)［6-9］，擬南芥NTM1參與細(xì)胞分裂過程［10］，AtNAC2參與激素調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］，水稻OsNAC5調(diào)控植株衰老［12］。馬鈴薯（Solanum tuberosum）StNAC和水稻RIM1等參與生物脅迫中植物的防御響應(yīng)［13-14］。甜菜NAC家族成員對(duì)干旱脅迫有響應(yīng)［15］。

真核基因表達(dá)由位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開始以及準(zhǔn)確性，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。啟動(dòng)子序列基本結(jié)構(gòu)特征是，在序列-30-20 bp處，有TATA序列，在-78-70 bp處，有CAAT區(qū)［16］。同時(shí)，啟動(dòng)子還含有特異順式作用元件。啟動(dòng)子主要分為3種，分別為組成型、組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［17］。啟動(dòng)子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要，其順式作用元件種類以及數(shù)量會(huì)影響基因的表達(dá)模式和強(qiáng)度［18］。分析基因啟動(dòng)子順式元件，有利于了解該基因的表達(dá)模式以及功能研究。

中間錦雞兒（Caragana intermedia）是生長(zhǎng)于干旱地區(qū)的灌木，有防風(fēng)固沙的作用［19］。中間錦雞兒對(duì)非生物脅迫有較強(qiáng)的耐受性，已有研究證明，中間錦雞兒基因在逆境脅迫下有響應(yīng)。如CiNAC3和CiNAC4過表達(dá)擬南芥對(duì)鹽脅迫有耐受性［20］。轉(zhuǎn)CiPP2C37-Like基因的擬南芥在鹽和干旱脅迫下，耐受性明顯強(qiáng)于野生型［21］。CiMYB68受干旱、冷脅迫的誘導(dǎo)［22］。轉(zhuǎn)CiDREB1C基因的擬南芥提高了對(duì)滲透脅迫和冷脅迫的耐受性［23］。研究中間錦雞兒的基因功能為對(duì)探究響應(yīng)逆境基因機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究以中間錦雞兒為植物材料，對(duì)CiNAC038啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和順式作用元件分析。構(gòu)建ProCiNAC38:GUS表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織定位和激素誘導(dǎo)表達(dá)特性分析，明確CiNAC038的表達(dá)調(diào)控模式，旨為CiNAC038功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 中間錦雞兒采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市，野生型擬南芥為Columbia-0生態(tài)型。

1.1.2 載體和菌株 克隆載體pEASY-T1和Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自全式金公司，克隆載體pMDTM19-T購自TaKaRa公司。表達(dá)載體pCambia1305.2由實(shí)驗(yàn)室保存。根據(jù)韓曉敏［20］方法自制根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根）提取中間錦雞兒的gDNA。

1.2.2 啟動(dòng)子的克隆 在目的基因cDNA內(nèi)設(shè)計(jì)的引 物 38-SP1、38-SP2和 38-SP3與 Genome Walking Kit（TaKaRa）提供的通用引物進(jìn)行3輪半巢式PCR（表1），回收第三輪得到的產(chǎn)物，與pMDTM19-T載體連接，并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與目的基因的cDNA拼接無誤。

以中間錦雞兒gDNA為模板，以拼接結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增啟動(dòng)子引物（表1）。PCR體系按說明書進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，回收產(chǎn)物，與pEASY-T1載體連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，用特異性引物菌落PCR法驗(yàn)證陽性克隆，并送測(cè)序。

1.2.3 序列分析 由在線軟件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 用HindⅢ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶（Thermo）對(duì)CiNAC038啟動(dòng)子和pCambia1305.2進(jìn)行雙酶切，回收目的條帶，使用In-Fusion方法與pCAMBIA1305.2線性載體連接，構(gòu)建ProCiNAC038∶GUS過表達(dá)載體。In-Fusion連接體系為:酶切后線性載體3 μL、目的基因片段1 μL、5×In-Fusion Enzyme（TaKaRa）2 μL 和 ddH2O 4 μL。37℃水浴 15 min，50℃水浴 15 min。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，用雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。使用質(zhì)粒小提試劑盒（天根）將重組質(zhì)粒從大腸桿菌中提取。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，浸染野生型擬南芥，收取種子，用含13 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基篩選陽性株系。

表1 所用引物

1.2.5 GUS組織化學(xué)染色 根據(jù)萬東莉［24］方法進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。

1.2.6 激素處理 將ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因植株在含潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基平板上豎直生長(zhǎng)7 d，然后移入含激素的1/2 MS培養(yǎng)基平板上繼續(xù)豎直生長(zhǎng)48 h，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析。

2 結(jié)果

2.1 CiNAC038啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)CiNAC038的ORF序列，設(shè)計(jì)3條反向特異性引物38-SP1、38-SP2和38-SP3（表1）。使用染色體步移法，以中間錦雞兒gDNA為模板，擴(kuò)增CiNAC038的啟動(dòng)子序列（圖1）獲得一條約2 000 bp條帶，經(jīng)測(cè)序，該條帶1 800 bp。

2.2 ProCiNAC038∶GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)擴(kuò)增獲得的CiNAC038啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物（表1）。以中間錦雞兒gDNA為模板，克隆CiNAC038啟動(dòng)子（圖2-A）。將pCAMBIA1305.2載體使用HindⅢ和NcoⅠ內(nèi)切酶線性化后，用In-Fusion體系與PCR產(chǎn)物連接構(gòu)建ProCiNAC038∶GUS表達(dá)載體。經(jīng)雙酶切后，產(chǎn)生目片段和線性化載體（圖2-B），表明ProCiNAC038∶GUS表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 CiNAC038啟動(dòng)子的克隆

圖2 CiNAC038啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體酶切驗(yàn)證

2.3 CiNAC038啟動(dòng)子順式元件分析

經(jīng)PlantCARE網(wǎng)站在線分析，CiNAC038啟動(dòng)子包含多種順式元件:真核生物常見轉(zhuǎn)錄元件CAAT-box和TATA-box；植物光響應(yīng)元件Box4、G-box、GATA-motif、I-box、MER、TCCC-motif；植物激素脫落酸應(yīng)答元件ABRE；茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif；赤霉素應(yīng)答元件P-box；厭氧誘導(dǎo)順式元件ARE；分生組織表達(dá)元件CAT-box；玉米素代謝調(diào)控元件O2-site；MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)元件CCAAT-box；細(xì)胞生長(zhǎng)周期調(diào)控元件MSA-like等（圖3）。

2.4 ProCiNAC038∶GUS組織化學(xué)染色

圖3 CiNAC038啟動(dòng)子順式元件分析

使用浸花法將ProCiNAC038∶GUS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥植物。用潮霉素篩選獲得8個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的T2代轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥進(jìn)行染色，觀察組織化學(xué)染色情況。選擇種子萌發(fā)48 h、5 d、10 d以及植物生長(zhǎng)40 d。植物幼苗時(shí)期，染色主要集中在根和根與胚軸的結(jié)合部位附近，子葉有不完全染色，胚軸無染色（圖4-a-圖4-f）。植物生長(zhǎng)40 d，對(duì)植物蓮座葉、花、莖及成熟果莢染色分析，染色部分主要集中在葉片葉脈、果莢兩端、花瓣、花萼以及花藥，莖無染色。野生型植物在不同生長(zhǎng)時(shí)期及不同組織中均沒被染色（圖4-i- 圖 4-r）。

圖4 ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因株系和野生型植物的組織化學(xué)染色

2.5 ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因植物激素處理組織化學(xué)染色

CiNAC038啟動(dòng)子順式元件中存在多個(gè)與可能與激素應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，如存在1個(gè)MeJA、1個(gè)GA和3個(gè)ABA應(yīng)答元件。為了進(jìn)一步分析CiNAC038啟動(dòng)子對(duì)植物激素的響應(yīng)情況，分別用MeJA、ABA和GA處理生長(zhǎng)10 d的ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因幼苗植物，并進(jìn)行組織化學(xué)染色分析。 經(jīng) 50和 100 μmol/L的 MeJA和 GA處 理 后，CiNAC038啟動(dòng)子染色結(jié)果沒有明顯變化；經(jīng)50和100 μmol/L的ABA處理后，隨著ABA濃度增加染色變淺，說明ABA負(fù)調(diào)控該基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，CiNAC038啟動(dòng)子可能是ABA抑制型啟動(dòng)子（圖5）。

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)過程中起重要作用［5，7，9，15］。本研究從中間錦雞兒中成功克隆出CiNAC038的啟動(dòng)子序列，PlantCARE預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的作用元件，結(jié)果顯示該啟動(dòng)子含有TATA-box和CAAT-box。TATA-box是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)［25］。CAAT-box調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始頻率和目的基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度［26］。說明所克隆的片段具有典型啟動(dòng)子的特征。該啟動(dòng)子存在著多種光應(yīng)答元件，同時(shí)還存在激素響應(yīng)元件和抗逆境應(yīng)答元件，顯示該啟動(dòng)子的功能可能受光信號(hào)、植物激素和抗逆境脅迫的調(diào)控［27］。如植物激素脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif和赤霉素應(yīng)答元件P-box等。因此，該啟動(dòng)子會(huì)受多種激素誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)。通過PlantCARE分析CiNAC038同源擬南芥基因AtNAC038啟動(dòng)子序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列也包含多種與激素相關(guān)順式元件，如植物激素脫落酸應(yīng)答元件ABRE、茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif、赤霉素應(yīng)答元件P-box、水楊酸應(yīng)答元件TCA-element等。包括2個(gè)MeJA、1個(gè)GA、5個(gè)ABA以及2個(gè)SA應(yīng)答元件。說明CiNAC038同源基因可能與激素相關(guān)。

圖5 不同處理下ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因植物組織化學(xué)染色分析

本研究成功構(gòu)建了ProCiNAC038∶GUS融合基因，轉(zhuǎn)入擬南芥，GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子在擬南芥幼苗根部染色較深，胚軸無染色；成熟期轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉脈、果莢兩端、花瓣、花藥等組織染色較深，莖無染色。結(jié)果顯示，CiNAC038啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)基因主要在葉片、根和花的組織器官表達(dá)。

為驗(yàn)證CiNAC038啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)特性，本研究分別用MeJA、ABA和GA等處理ProCiNAC038∶GUS轉(zhuǎn)基因幼苗植物，并進(jìn)行組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，在MeJA和GA處理后，CiNAC038啟動(dòng)子染色結(jié)果沒有明顯變化。ABA處理下，隨著ABA濃度增加染色變淺，說明ABA負(fù)調(diào)控該基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，表明CiNAC038啟動(dòng)子是ABA抑制型啟動(dòng)子。

4 結(jié)論

從中間錦雞兒中克隆與激素相關(guān)基因CiNAC038上游1 800 bp的啟動(dòng)子序列，CiNAC038啟動(dòng)子主要在葉片、根和花的組織器官表達(dá)；CiNAC038受外源激素ABA誘導(dǎo)。