植物miRNA作用方式的分子機制研究進展

張翠桔 莫蓓莘 陳雪梅 崔潔

（深圳大學生命與海洋科學學院，深圳 518037）

MicroRNA（miRNA）是一類真核生物中廣泛存在的約20-24個核苷酸（Nucleotide，nt）長度的內源非編碼單鏈RNA，成熟的miRNA與Argonaute（AGO）家族蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）， 在轉錄后水平負調控基因表達。miRNA在生物的細胞增殖分化、生長發育和響應外界環境信號等多種生物過程中發揮重要作用。1993年和2000年，Ambros與Reinhart的研究小組分別先后在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中鑒定了最早的動 物 miRNA，lin-4和let-7［1-2］。2002 年 Bartel、Carrington與Chen分別帶領各自的研究小組發現了植物擬南芥中的miRNA［3-5］。幾十年來，科學家已經在動植物中發現了數以萬計的miRNA，2018年10月miRBase收錄了38 589條miRNA前體信息，這些前體共計產生48 860條不同的成熟miRNA；其中人類基因組中鑒定發現2 654個成熟miRNA，擬南芥中發現428個成熟miRNA［6］。有關miRNA產生的生物學過程、功能分析、逆境脅迫等方面的研究報道逐年攀升，miRNA已然成為科學研究領域炙手可熱的“明星分子”。

2002年，研究者們發現植物中第一個miRNA，“miR171”，同時發現植物miRNA與靶基因序列高度互補配對的特性［3-5］。在此之前的1999年，植物中首次發現了小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA與靶基因完全互補配對，通過剪切靶基因mRNA調控基因的表達［7］。基于siRNA作用機制的啟示，Llave［4］發現miR171也是通過剪切mRNA沉默靶基因。有趣的是，miR171既是植物miRNA作用方式的第一個實例，也是植物中少數與靶基因完全互補配對的miRNA之一。在miRNA被陸續發現和報道的前期，通過定量PCR檢測mRNA水平的實驗技術非常成熟，對靶基因mRNA水平的檢測成為早期主流手段，因此植物miRNA對靶基因mRNA剪切的現象被大量報道。然而，蛋白水平的檢測需要借助特異性強且靈敏度高的抗體，植物蛋白抗體開發的不足大大限制了對miRNA靶基因蛋白水平的檢測。以上因素綜合作用造成了長期以來該領域的觀點認為，植物miRNA主要通過剪切靶基因mRNA發揮作用。隨后開始有報道發現有的植物miRNA并不影響靶基因mRNA的水平，而是降低靶基因蛋白的水平［8-10］，由此提出植物miRNA也存在與動物miRNA類似的抑制蛋白翻譯的作用機制。Brodersen等［11］發現了擬南芥中多個miRNA可以介導翻譯抑制，并且通過突變體篩選報道了數個影響miRNA翻譯抑制的基因，為植物miRNA翻譯抑制機制的廣泛存在提供了遺傳學的證據支持。近些年的研究報道進一步揭示了植物miRNA翻譯抑制的普遍性。迄今為止，植物miRNA主要通過剪切mRNA和翻譯抑制兩種方式對靶基因進行負調控，已經成為該領域最新的共同認知。

自植物miRNA首次被報道以來，近十幾年的研究已經對miRNA的生物學發生與降解，及其參與的生物學過程等方面作了清晰的闡述，也有不少文獻針對上述內容進行了很好的總結［12-16］。相比在動物中的研究，miRNA在植物中作用方式的分子機制的報道相對匱乏和滯后。對植物miRNA-RISC復合體核心效應因子AGO1的功能解析，結合mRNA降解通路的基因功能研究，闡明了miRNA對靶基因的切割以及隨后的mRNA降解機制；相比之下，在翻譯抑制方面，盡管發現了一系列影響miRNA翻譯抑制的基因，但是這些基因影響這一過程的分子機制仍然不夠清晰。本文將回顧和概述植物miRNA作用機制的發現過程與最新的研究進展，系統地總結植物miRNA介導的mRNA剪切和翻譯抑制這兩種主要作用方式的發生、產生的結果（靶基因mRNA降解、次生小干擾RNA發生）和影響因素等方面的研究進展。本文也將討論miRNA發生作用的亞細胞場所，以及不同作用機制的聯系和區別。綜合以上信息，文末將對該領域內未來的研究方向進行展望，同時提出一些亟待解決的問題并進行討論。

1 miRNA介導的靶基因mRNA剪切

動物miRNA與靶基因匹配程度不高（配對僅限于種子序列區域（Seed region）），因此無法直接剪切mRNA［17］。動物miRNA通過RISC復合體招募去腺苷化酶和脫帽蛋白對mRNA進行降解［18］。相比之下，植物miRNA與靶基因的互補配對程度遠大于動物miRNA，大部分只存在4個堿基以下的錯配，主要通過對靶基因mRNA的剪切發揮沉默效應，作用方式與siRNA類似。迄今為止，既沒有生化證據表明在植物中存在與動物中類似的，不依賴剪切的mRNA降解機制［19］，在AGO1剪切活性缺陷突變體的轉錄組數據中也未檢測到這一類機制的明確存在［20］。由于實驗手段的限制，早期僅能通過Northern Blot和5'cDNA末端快速擴增技術（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）鑒定和克隆到少數miRNA剪切的靶基因片段；mRNA被miRNA 切割后的3'端片段暴露出5'單磷酸基團，該結構能夠被連接酶捕獲并添加接頭構建得到降解組文庫。得益于近些年測序技術的不斷發展，對3'切割產物（降解組）進行高通量測序和分析，German等［21］發現大部分擬南芥miRNA都存在對靶基因mRNA進行剪切的作用方式。

植物miRNA主要通過AGO蛋白的核酸內切酶活性發揮作用。AGO蛋白是一類進化上非常保守的蛋白，廣泛存在于細菌、古生菌、真菌、植物和動物中［22］。擬南芥AGO蛋白家族有10個成員（AGO1-10），其中AGO1結合絕大多數的miRNA發揮作用［23-24］，此外AGO2、AGO4、AGO7和AGO10也可以結合部分miRNA發揮剪切功能［25-30］。成熟的miRNA與AGO蛋白組裝成miRNA-RISC復合體，miRNA引導及識別與自身核苷酸互補配對的靶基因mRNA并與之結合；AGO1蛋白保守的PIWI結構域具有類似RNA酶H催化中心的三級結構［31］，特異性地在miRNA第10-11位對應的靶基因mRNA位置切斷核苷酸之間的磷酸二酯鍵［32］，產生5'端包含帽子結構和3'端帶有polyA尾的兩段切割產物。

經miRNA剪切后的mRNA 5'和3'端片段進入核酸外切酶降解途徑。Northern blot檢測結果發現3'切割產物更容易被檢測到，意味著5'切割產物更容易被降解，而3'切割產物更穩定［4］。在擬南芥中，催化降解3'切割產物的是一類5'-3'的外切酶EXORIBONUCLEASE 4（XRN4）［33］（圖 1-b，mRNA剪切）。miRNA 5'切割產物的降解步驟相對復雜，擬南芥的核酸轉移酶HEN1 SUPPRESSOR 1（HESO1）以及其同源蛋白RNA URIDYLYLTRANSFERASE 1（URT1）對其3'末端進行尿苷化修飾能夠加速5'切割產物的降解［35-36］（圖1-b，mRNA剪切）。在萊茵衣藻中，5'切割產物的3'末端被HESO1同源蛋白核酸轉移酶MUT68腺苷化［34］。最近的研究發現，擬 南 芥RICE1（RISC-INTERACTING CLEARING3'-5'EXORIBONUCLEASE 1）在尿苷化的5'切割產物隨后的降解過程中發揮重要作用［37］（圖1-b，mRNA剪切）。RICE1是AGO1蛋白的輔因子，結構上與3'-5'外切酶DnaQ家族類似，RICE1催化活性的缺失導致尿苷化的5'切割產物在突變體內過度積累［37］。此外，在xrn4突變體中也報道了5'切割產物的異常積累，表明XRN4也參與了5'切割產物的降解［35］。早期對細胞質外切體（Exosome）相關基因突變體csl4和rrpl6的研究未發現明顯的5'切割產物的積累［35］，認為外切體不參與該降解步驟。直到2015年，Branscheid等［38］證實了組成外切體復合體的其他亞基突變體中5'切割產物存在積累的情況，表明該過程需要外切體輔因子的亞基SUPERKILLER2（SKI2），SKI3和SKI8的參與。因此，植物miRNA切割后產生的5'切割產物與果蠅和衣藻中siRNA切割后5'端片段的降解過程類似，均需要外切體的參與，外切體在這個過程中的作用機制是保守的［34，39］。

2 miRNA介導的翻譯抑制

2.1 植物中廣泛存在miRNA介導的翻譯抑制

1993年在C. elegans中報道了第一個鑒定到的miRNA“lin-4”，它的靶基因lin-14的mRNA無明顯變化，而蛋白水平下降［1］。基于以上發現，提出miRNA抑制蛋白翻譯過程這一作用機理，這是第一次提出“翻譯抑制”的概念。由于植物中第一例關于作用機制的報道中miR171是通過剪切靶基因mRNA發揮作用，以及植物蛋白抗體的匱乏，在研究早期，植物miRNA的主要作用方式被認為與siRNA一樣通過剪切mRNA實現。植物中被大家所熟知的首例miRNA介導的翻譯抑制發生在花序組織中:擬南芥miR172使參與花器官發育調控的靶基因APETALA 2（AP2）的蛋白水平下降，而mRNA水平無明顯變化［8-9］。植物中第二個發現的介導翻譯抑制的miRNA參與開花時間的調控:miR156/157識別和結合靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 3（SPL3），通過翻譯抑制引起基因沉默，抑制植物早花現象［10］。Brodersen 等［11］通過正向遺傳學方法篩選影響miRNA作用機制突變體時發現，包括miR171、miR395、miR398和miR834在內的miRNA均可以降低其相應靶基因SCARECROWLIKE PROTEIN 4（SCL4），ATP SULFURYLASE 1（APS1），COPPER/ZINC SUPEROXIDEDISMUTASE 2（CSD2），COP1-INTERACTING PROTEIN 4（CIP4）的蛋白水平而mRNA水平未出現明顯變化，表明翻譯抑制是植物中廣泛存在的一種機制；該報道不僅發現了影響miRNA剪切靶基因mRNA的突變體，還鑒定到了一系列影響miRNA翻譯抑制的突變體（ktn1、vcs、ago1、ago10，后續章節具體闡述），為翻譯抑制在植物體內的發生奠定了遺傳學基礎。2010年，Alonso-Peral等［40］通過比較miR159靶基因MYB DOMAIN PROTEIN 33（MYB33）的轉錄本和蛋白的相對豐度，發現miR159也能介導翻譯抑制。

圖1 植物miRNA作用方式的模型（改自Yu等［16］）

盡管通過比較靶基因mRNA和靶蛋白穩定狀態相對豐度的方法發現了許多植物miRNA介導翻譯抑制的例子，然而直到2013年還沒有直接的證據證明miRNA-RISC復合體可以抑制靶蛋白的翻譯過程。2013年Li等［41］通過放射性同位素標記追蹤miRNA靶基因蛋白合成速率的變化，證實miR398和miR165/166抑制其相應靶基因CSD2和PHABULOSA（PHB）的蛋白合成，且新生成的蛋白量降低這一過程依賴ALTERED MERISTEM PROGRAM1（AMP1）。Liu等［42］通過核糖體組學分析發現miRNA靶基因的編碼區上附著的核糖體密度降低，miRNA靶基因在核糖體上的翻譯效率顯著低于非靶基因，而靶基因與非靶基因的穩態mRNA水平并沒有明顯差異。在影響翻譯抑制的DOUBLE-STRANDED RNABINDING 2（DRB2）基因的報道中指出，DRB2及其同源基因在苔蘚和早期基部被子植物中已經存在，且氨基酸的保守程度非常高，暗示了其功能的保守性，以及在遠古的植物中可能已經存在DRB2介導的翻譯抑制機制［43］。綜上所述，越來越多的證據支持miRNA介導的翻譯抑制在植物中的普遍存在。

2.2 影響miRNA翻譯抑制的基因

動物miRNA主要通過翻譯抑制發揮作用，具體機制得到了比較深入的研究。動物miRNA組裝成RISC復合體之后，通過miRNA第2-8位的“種子序列”與靶基因mRNA 3'非編碼區（Untranslated region，UTR）互補配對。動物的miRNA-RISC復合體包括AGO2蛋白和支架蛋白GW182。GW182是miRNA發揮翻譯抑制作用的重要橋梁因子，GW182不僅可以與AGO2蛋白相互作用，也可以與mRNA去穩定化及翻譯過程的眾多因子相互作用［18］。動物實驗研究表明，GW182介導的翻譯抑制機制既包括使polyA結合蛋白（Poly A binding protein，PABP）從mRNA上脫落［44］，也包含招募翻譯阻遏物的參與［18］。然而植物中不存在GW182的同源蛋白［45］，暗示了植物翻譯抑制機制與動物的差異。對植物AGO1相關蛋白的研究發現了一系列促進RISC復合體組裝、miRNA裝載的基因，例如HEAT SHOCK PROTEIN 90（HSP90）［46］，CYCLOPHILIN-40（CYP40）［47］和TRANSPORTIN1（TRN1）［48］等，遺憾的是，并沒有直接線索顯示這些與AGO1相關的蛋白與翻譯抑制機制相關。

近年來陸續報道了為數不多的影響植物miRNA翻譯抑制的基因。2008年，Brodersen等［11］通過正向遺傳篩選突變體的方法，發現微管切割酶KATANIN 1（KTN1）基因的突變體中miRNA靶蛋白的水平明顯升高而mRNA水平變化不大。KTN1編碼微管切割酶中的P60亞基，暗示細胞微管可能參與翻譯抑制［11］。Brodersen 等［11］還發現加工小體（the processing body，P body）的組分VARICOSE（VCS）影響miRNA介導的翻譯抑制。無獨有偶，2012年Yang等［49］發現另一個加工小體的組分SUO基因的突變體與AGO1活性降低的突變表型類似，進一步的研究發現該基因的突變導致miRNA翻譯抑制功能受到影響。加工小體是細胞質中一類由核糖核蛋白聚集形成的亞細胞結構，目前其已知的組分包含脫帽復合體的成員VCS、DECAPPING1（DCP1）和DECAPPING2（DCP2）以及AGO1［50］、XRN4［51］和SUO［49］。VCS是脫帽復合物中的一種蛋白，其外切酶活性以5'-3'的方向降解mRNA［11］。SUO基因編碼的蛋白在C端有兩個GW（Glycine and tryptophan）重復序列［49］，從蛋白結構猜測SUO有可能是動物GW182在植物中特異存在的發揮類似作用的等價基因，但尚無證據表明SUO直接與AGO1蛋白結合。從AGO1、XRN4與加工小體的相關性可以推測VCS和SUO可能通過在加工小體中對一些需要被翻譯抑制調控的基因進行加工或者降解來參與miRNA介導的翻譯抑制［52］（圖1-a，翻譯抑制）。此外，Brodersen等［11］根據AGO家族中各個AGO蛋白與miRNA已知的聯系，結合突變體的表型，驗證發現AGO1和AGO10也參與植物miRNA介導的翻譯抑制。

2013年，Li等［41］報道了一種內質網膜整合蛋白 ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1） 及其同源蛋白LIKE AMP1（LAMP1）參與植物miRNA介導的翻譯抑制，這兩個蛋白均可以與AGO1相互作用并且與AGO1共定位在細胞內質網上（圖1-a，翻譯抑制）。利用同位素標記檢測新合成蛋白量的實驗表明，在半衰期內一定時間中，amp1突變體中miRNA對靶基因蛋白生成量的抑制能力降低，表明靶基因的翻譯抑制依賴AMP1的作用［41］。相比野生型，miRNA靶基因mRNA在amp1突變體的膜結合多聚核糖體中發生顯著富集，以上證據表明AMP1通過抑制mRNA的翻譯起始發揮功能［41］。雙鏈RNA結合蛋白DRB是植物中一類保守的蛋白，擬南芥中包含5個家族成員，DRB1-5，其中最被熟知的DRB1（即HYL1）參與miRNA的生物合成。有趣的是，Reis等［43］對野生型和drb2突變體材料同時進行轉錄組和蛋白組學分析時，發現蛋白組學分析鑒定到的miRNA靶蛋白水平升高而對應的mRNA水平與野生型無異，意味著DRB2參與翻譯抑制過程，然而作者并未對DRB2影響翻譯抑制的分子機制展開挖掘和論述。

諸多報道發現了一系列僅在蛋白水平影響miRNA 靶基因的突變體［11，41，49］；2009 和 2013 年兩篇文獻均報道AGO1的剪切活性被抑制時翻譯抑制所受影響不顯著［19，53］；利用體外組裝的RISC復合體檢測發現在miRNA-靶基因剪切位點附近（中心配對區）引入錯配，依然能發生顯著水平的翻譯抑制［19］。以上證據表明miRNA介導的剪切和翻譯抑制是兩種相互獨立的機制。目前已知的影響翻譯抑制基因的報道并未闡明這一調控方式具體的分子機制。最新的一項以萊茵衣藻為對象的研究發現，VASA INTRONIC GENE 1（VIG1）基因編碼的蛋白能夠與AGO蛋白相互作用，是RISC復合體的組分之一，也與多聚核糖體組分相關聯，影響翻譯抑制，并可能調節蛋白質合成的多個步驟［54］。衣藻VIG1在酵母、果蠅和哺乳動物中的同源基因與核糖體小亞基蛋白RACK1（RECEPTOR FOR ACTIVATED PROTEIN C KINASE 1）及影響翻譯延伸的蛋白相關，并且影響翻譯抑制［55-56］。擬南芥中，RACK1通過與miRNA加工復合體蛋白SERRATE（SE）相互作用影響miRNA前體的加工；此外免疫共沉淀實驗和蛋白共定位結果表明RACK1是AGO1復合體的組分。線蟲rack1突變體中miRNA表達量升高，然而利用RNA干擾技術敲除線蟲的RACK1基因導致miRNA靶基因蛋白水平的升高，表明動物的RACK1參與翻譯抑制的過程［57］。在擬南芥中，由于rack1突變體中多數miRNA產生減少，靶蛋白水平的升高不能簡單歸因于RACK1影響miRNA介導的翻譯抑制，這使得RACK1與翻譯抑制關系的探究變得富有挑戰性［58］。VIG1在擬南芥中有3個同源基因（AT4G16830、AT4G17520、AT5G47210）尚未有這3個基因與miRNA作用機制相關的報道［54］。

2.3 影響mRNA剪切或翻譯抑制的因素

植物miRNA與動物miRNA的主要差異有兩點:第一，與靶基因互補配對程度不同，植物中互補配對程度遠高于動物中依賴種子序列的配對；第二，miRNA結合靶基因位置不同，植物miRNA主要結合靶基因編碼區，動物主要結合3' UTR。小鼠miR196除了一個G-U錯配，基本與靶基因HOXB8完全互補配對，是動物中為數不多的執行mRNA剪切的miRNA之一［59］。植物中首例解析的miRNA作用機制也是與靶基因完全互補配對并且剪切mRNA［4］。因此早期觀點認為近乎完全的互補配對是發生靶基因剪切的分子基礎。動物miRNA結合在靶基因的3'UTR并且翻譯抑制是其主要的作用機制［8-10］；植物miR156/157是最早發現的翻譯抑制的例子之一，它與靶基因SPL3的3' UTR區結合，暗示結合位點可能也是影響作用機制的重要因素。

早期Brodersen等［11］對結合位點和互補程度各不相同的一系列miRNA靶基因mRNA和蛋白水平分析發現沒有明顯的規律，提出靶基因剪切或者翻譯抑制與mRNA靶位點在基因上的位置（5' UTR、編碼區或3' UTR）和互補配對程度無關。動物中的研究也發現動物miRNA無論在編碼區還是3' UTR都可以實現翻譯抑制［60］。另一方面，植物miRNA與靶基因幾乎完全互補配對，而翻譯抑制廣泛存在，說明互補配對程度并不影響miRNA沉默機制的選擇，Brodersen等［11］通過人為引入堿基錯配也已經加以證明。衣藻中miRNA報告基因的研究發現miRNA與靶基因mRNA完全互補配對仍然可以引起翻譯抑制［61］。利用農桿菌侵染在煙草細胞中瞬時表達miRNA及其靶標的報告基因，研究者們發現模擬動物中以種子序列與靶基因的配對形式，無論將結合位點設計在靶基因的UTR區還是基因編碼區，改造后的miRNA都不能發揮剪切或是翻譯抑制作用［62］。將純化的植物AGO蛋白與人工合成的miRNA在體外反應，能夠組裝成有生物活性的RISC復合體并發揮基因沉默作用［46］。2013年的一項研究基于上述體外系統對翻譯抑制的分子機制進行了解析［19］。通過在人工miRNA中引入錯配堿基并且檢測沉默效應，研究發現植物miRNA與動物相比確實需要更高的堿基配對程度才可以實現翻譯抑制；同時與衣藻中的發現類似，當植物miRNA與靶基因的完全互補配對發生在3' UTR時，也能夠實現翻譯抑制［19］。綜上所述，miRNA的結合位點和與靶基因互補的情況并不是影響作用機制選擇的重要因素，真正起決定作用的因素仍有待進一步研究。

2.4 植物miRNA翻譯抑制的分子機制初探

利用突變體和各種報告系統對miRNA作用方式分子機制的研究沒有得到明確的結論，一些體外的生化試驗為植物miRNA翻譯抑制分子機制的研究提供了一些線索。以熒光素酶作為報告基因，設計人工干擾miRNA使RISC復合體的結合位點位于編碼區時發現，miRNA的翻譯抑制作用引起全長的靶蛋白水平降低；有趣的是，與miRNA結合位點之前的編碼區區域對應的截短蛋白出現明顯的積累，然而在報告基因5' UTR設計的miRNA沒有檢測到截短蛋白的積累，表明RISC復合體結合在編碼區時能夠在空間上阻礙靶基因上正在翻譯的核糖體延伸［19］。體外實驗利用AGO1剪切活性位點突變的RISC復合體（翻譯抑制功能正常）與靶基因孵育后進行蔗糖密度梯度組分分析發現，完整的80S核糖體明顯減少，說明RISC復合體通過干擾核糖體組裝影響翻譯起始過程［19］。AMP1是翻譯抑制必需的，而amp1突變體中的靶基因在活躍翻譯的核糖體上的豐度高于野生型，說明AMP1的存在阻止靶基因mRNA進入翻譯機器，表明翻譯抑制是通過影響翻譯起始實現。此外，利用人工合成miRNA的報告株系檢測miRNA沉默效率探索發現，當miRNA與靶基因結合位點位于5'端起始密碼子前200堿基對范圍時能更加有效的實現翻譯抑制，也暗示了miRNA通過抑制翻譯起始過程發揮作用［63］。

核糖體印跡測序技術又稱ribo-seq（ribosomesequencing），是近些年新興的一種翻譯組學研究手段。利用RNA酶消化降解沒有被核糖體覆蓋的mRNA片段后，對被核糖體保護的RNA小片段添加接頭并進行測序；可以得到體內轉錄本上核糖體的分布和密度等信息，從而對翻譯過程進行直接研究。利用ribo-seq檢測植物體內miRNA對靶基因上核糖體結合情況的影響，能夠提供更貼近體內翻譯抑制作用機制的線索。當RISC復合體與靶基因的結合導致核糖體的延伸受阻時，在靶基因mRNA結合位點前后可能會出現核糖體的停滯或者堆積，然而在衣藻和擬南芥的ribo-seq數據中，均沒有發現剪切位點附近核糖體密度的明顯變化［42，54，64］。這一發現也更加支持miRNA在植物體內通過影響翻譯起始實現翻譯抑制的分子機制。

3 miRNA剪切的另一種結果:產生次生siRNA

3.1 phasiRNA與miRNA剪切

被miRNA剪切的mRNA除了進入核酸外切酶降解途徑以外，還有可能產生phasiRNA。phasiRNA的產生是植物中廣泛存在的一種保守機制，即miRNA對一類特殊的靶基因轉錄本的剪切可以觸發產生具有一定相位（Phase）的siRNA，稱為phasiRNA（Phased siRNA）。phasiRNA在擬南芥中的數目相對較少［65］，近些年伴隨著植物基因組數據的不斷披露，研究人員發現在玉米、水稻、短柄草等單子葉植物中存在大量的phasiRNA，這些物種的生殖組織中存在的數量尤為豐富［66-68］。通常來說，phasiRNA的生成由22 nt的miRNA觸發，與絕大多數編碼蛋白的靶基因不同的是，miRNA-RISC復合體切割PHAS轉錄本，產生的5'和3'片段會被SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3（SGS3）捕獲并穩定（圖1-c，產生次生siRNA），阻止了切割產物進入核酸外切酶的降解途徑；隨后RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 6（RDR6）將上述剪切片段復制成雙鏈RNA，之后DICER LIKE 4（DCL4）從頭開始以21堿基為單位連續剪切雙鏈RNA，形成具有一定相位的，頭尾相接的 21 nt雙鏈 siRNA［69］（圖 1-c，產生次生siRNA）。成熟的phasiRNA與AGO1組裝成沉默復合體，通過堿基互補配對作用于產生phasiRNA的轉錄本自身或者其同源基因，在轉錄后水平發揮負調控作用。其中一類特殊的phasiRNA來自一類長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的轉錄本“TAS”，因其最終產生的小RNA片段作用于非自身或同源的靶基因而被稱為反式作用小干擾RNA（trans acting siRNA，tasiRNA）。

phasiRNA主要來源于長鏈非編碼RNA，但也并非都產生于非編碼的轉錄本。基因組測序及生物信息分析發現部分編碼蛋白的基因，包括免疫反應受體NUCLEOTIDE-BINDING LEUCINE-RICH REPEAT（NBS-LRR）和PENTATRICOPEPTIDE REPEAT（PP R）家族以及轉錄因子MYB家族等，也能夠被22 nt的miRNA觸發產生phasiRNA，這一類phasiRNA可能在植物與有益微生物的相互作用或者防御外界脅迫中發揮功能［65］。

tasiRNA的產生起始于特定miRNA對TAS轉錄本的剪切，擬南芥中有4個TAS基因，TAS1-4［69-70］。根據TAS轉錄本中miRNA結合位點的數目，將tasiRNA的產生機制分為“one-hit model”和“two-hit model”。顧名思義，“one-hit model”中TAS初級轉錄本只有一個miRNA結合位點，引起切割的miRNA長度為22 nt［70］，由AGO1蛋白介導，在5'端進行剪切（圖1-c，產生次生siRNA）。“one-hit model”是主要的tasiRNA/phasiRNA產生模型。而“two-hit model”特異地用于解釋TAS3基因轉錄本的切割，TAS3轉錄本有兩個21 nt長度的miR390的結合位點，參與的AGO蛋白是AGO7而非AGO1，剪切點靠近3'端而非5'端［71］（圖1-c，產生次生siRNA）。“two-hit model”在植物中廣泛存在，然而在不同物種中的具體分子機制略有差別，在苜蓿和蘋果等物種中這些差異涉及參與的miRNA長度，結合的AGO蛋白成員以及剪切發生的位置［72-73］。

3.2 影響phasiRNA產生的因素

早期研究發現，“one-hit model”中能觸發tasiRNA產生的miRNA長度均為22 nt，而大部分miRNA的長度都是21 nt，不會產生tasiRNA，所以推測miRNA的長度對于tasiRNA的生成至關重要［65］。在這些報道中，一些miRNA以21 nt的標準形式存在時不會觸發phasiRNA的產生；當被添加額外一個配對堿基產生22 nt的異構體時，即可觸發產生phasiRNA［74-75］。此外在小RNA甲基化基因HEN1（HUA ENHANCER ONE）的突變體中，由于miR171的3'端沒有被甲基化保護，在核酸轉移酶URT1的催化下miR171的3'端添加了一個尿嘧啶，變成22 nt的miR171也導致phasiRNA的產生，而野生型中HEN1對miRNA 3'端甲基化阻止了尿嘧啶的添加，野生型中21 nt的miR171則不能產生phasiRNA［76］。

除了特定的長度以外，其他影響phasiRNA產生的因素也被陸續報道。2012年，Manavella等［77］發現21 nt的miRNA和22 nt的互補鏈miRNA*組成的非對稱結構也能觸發tasiRNA的產生。通過在報告基因不同位置引入miRNA靶位點，Zhang等［78］發現終止密碼子緊挨著位于miR173靶位點上游時，tasiRNA產量最高；而終止密碼子相距靶位點上游存在一定間隔時，翻譯提前終止，tasiRNA生成被抑制，說明翻譯過程對于tasiRNA生成也很關鍵。擬南芥TAS基因上存在一些短的讀碼框，TAS2的其中一個短讀碼框包含了miR173的結合位點，體外實驗表明這個短的讀碼框可以被翻譯產生短肽；利用煙草報告系統的實驗發現，該讀碼框在miR173識別位點上游一段距離處發生的無義突變，造成tasiRNA的積累降低［79］，這一現象與Zhang等［78］的發現一致；然而在擬南芥體內這些讀碼框對tasiRNA產生的影響并不清楚。miRNA的3'端與靶基因的配對程度也會影響tasiRNA的生成:在miRNA的3'端引入錯配堿基會抑制tasiRNA的生成［78］。此外，觸發phasiRNA生成的miRNA與細胞內膜結構關聯程度的降低，也會使體內phasiRNA的豐度降低或者導致其相位特征的喪失［80］。最近的一項研究報道了與已知tasiRNA生成模型不完全相符的現象:在AGO1剪切活性缺陷的擬南芥幼苗中，體內的tasiRNA位點產生仍然可以產生大量siRNA；這些siRNA的產生同樣依賴于RDR6和SGS3，不同的是，它們失去了“相位”特征。該研究表明miRNA-RISC復合體對TAS的剪切決定了tasiRNA產生的“相位”特征，而非tasiRNA產生與否的決定因素［81］。

4 miRNA介導的剪切和翻譯抑制發揮活性的亞細胞場所

AGO1在miRNA-RISC復合體中發揮核心功能，因此AGO1的亞細胞定位暗示了復合體發揮活性的場所。近幾年一系列AGO1在細胞核里的新功能被挖掘和報道［82］，然而被調控的靶蛋白的翻譯過程在細胞質中完成，因此AGO1在細胞質中的分布更能體現其作用的場所。通過熒光蛋白標記結合激光共聚焦顯微鏡觀察發現，AGO1在細胞質和細胞的核膜周圍富集［83］。Li等［41］通過熒光標記發現 AGO1在某種細胞質顆粒中積累，這種顆粒狀信號與內質網標記重合；AGO1與定位在粗面內質網的膜整合蛋白AMP1的相互作用進一步證實了AGO1在內質網的分布（圖1）。內質網作為一種膜結構，是細胞內蛋白質翻譯的重要場所，粗面內質網上附著了mRNA與大量正在執行翻譯功能的核糖體。眾多核糖體聚集在內質網上被稱為膜結合多聚核糖體（Membrane bound poly-ribosome，MBP），多聚核糖體在細胞質和內質網上進行著活躍的蛋白翻譯過程。2009年Lanet等［53］在多聚核糖體組分中檢測到一些miRNA的分布，隨后Li等［41］利用大規模組學測序證實擬南芥中大量miRNA以及其對應的靶基因在MBP的明顯富集。AMP1及其同源基因LAMP1參與miRNA介導的翻譯抑制，而與mRNA的剪切無關。在amp1 lamp1雙突變體中，檢測到細胞內總多聚核糖體（包含膜結合多聚核糖體和游離多聚核糖體）中miRNA 靶基因mRNA的量與野生型無差別，而MBP中靶基因mRNA的豐度高于野生型，說明AMP1的存在抑制mRNA在粗面內質網的聚集，從而導致翻譯抑制，由此推斷miRNA介導的翻譯抑制可能發生在粗面內質網上。

除了粗面內質網以外，AGO1與細胞中的加工小體緊密相關［84］。加工小體中含有許多與mRNA降解相關的蛋白因子，通過募集靶基因mRNA抑制翻譯過程（圖1-a，翻譯抑制），可能參與細胞應對環境脅迫的響應［85］。在擬南芥中，早期的研究報道發現兩個影響翻譯抑制的蛋白，其中VCS是加工小體的組成因子，SUO與加工小體存在共定位［11，49］（圖1-a，翻譯抑制）。另一個影響翻譯抑制的基因KTN1與細胞微管結構相關［11］，可見植物中多種細胞結構都參與了miRNA介導的翻譯抑制，然而尚不清楚加工小體與微管如何調控翻譯抑制，以及這些細胞活動是如何共同協調發揮作用的。

對miRNA介導mRNA剪切發生的亞細胞場所的報道較少。類異戊二烯可能影響AGO1與膜結構的相關性，在類異戊二烯合成酶基因HYDROXY METHYLGLUTARYL COA REDUCTASE 1（HMG1）突變體中AGO1與膜的相關程度降低，同時miRNA剪切效率也降低［86］，結合已知的內質網膜與AGO1的相關性［41］，暗示剪切的發生場所也是粗面內質網。進一步針對mRNA降解產物的全基因組測序結果表明，miRNA靶基因在與正在翻譯的核糖體結合的狀態下被切割［64，87］。MBP的組分測序分析也發現了許多miRNA剪切后產生的3'切割產物［80］。由此我們可以推測，至少部分miRNA對mRNA的剪切發生在粗面內質網上，同時剪切過程的發生與翻譯過程偶聯。

phasiRNA產生的第一步也是miRNA的切割，研究發現包括長度為22 nt的miRNA（phasiRNA trigger）在內的所有miRNA都富集在MBP上；ago1-27突變體中檢測到22 nt的miRNA與MBP這一膜結構的結合能力下降，伴隨phasiRNA的豐度下降［80］。能夠生成phasiRNA的TAS雖然是一類長鏈非編碼RNA，但是其序列上存在一些短的開放式閱讀框，使TAS轉錄本與核糖體結合［64］，甚至特異地與MBP結合［80］。綜合以上發現表明，miRNA對PHAS的剪切步驟也發生在膜結合多聚核糖體上。

5 總結與展望

植物miRNA對mRNA進行直接剪切或者抑制其翻譯實現對靶基因的轉錄后負調控。miRNARISC復合體利用miRNA與靶基因的互補配對找到靶位點［21］，并且發揮AGO1蛋白PIWI結構域的核酸外切酶活性切割靶基因mRNA［31］，切割片段隨后被5'-3'核酸外切酶XRN4和外切體降解［35］。對于體內的許多miRNA來說，剪切不是唯一的作用機制，類似動物中的翻譯抑制也在植物中大量存在［8-10，11，41，43，49］，盡管近十幾年的研究揭示了一系列影響 miRNA 翻譯抑制的重要基因［11，41，43，49］，但是多數僅限于在相應基因的突變體中發現翻譯抑制受到影響的現象，對于這些基因在分子層面調控翻譯抑制的機制仍不清楚。基于影響翻譯抑制的內質網膜整合蛋白AMP1 的相關研究及植物中的riboseq 數據［41，54，64］，當前的研究比較支持植物 miRNA對翻譯抑制的調控是通過抑制翻譯起始過程實現的；動物中這一過程的實現主要依靠AGO2的互作蛋白GW182實現［44］，然而植物中GW182同源基因的缺失使植物中的作用機制變得更為復雜［45］。植物中影響翻譯抑制的蛋白“SUO”含有動物GW182蛋白的GW保守結構域［49］，但是其是否與AGO1存在相互作用還有待進一步的驗證。盡管有一些研究報道了能夠與植物AGO1相關或者存在相互作用的蛋白，但多數與RISC復合體的組裝和AGO1自身的降解或者再循環有關［46-48］。核糖體小亞基蛋白RACK1被報道存在于AGO1復合體中，然而一方面RACK1的突變影響了體內大多數miRNA的生成［58］，另外也并沒有檢測到其與AGO1的直接相互作用。綜上所述，目前并未找到植物中能夠與AGO1互作的，明確與翻譯過程相關的因子或者類似GW182的橋梁蛋白，miRNA抑制翻譯起始影響蛋白翻譯的分子機制有待進一步挖掘。從最新的藻類VIG1的功能研究中可以得到啟示［54］，植物中存在一些潛在的與動物中已知影響翻譯抑制基因的同源基因，其功能機制尚未得到闡述，對這部分基因的深入挖掘將為我們提供新的線索。此外，設計翻譯抑制報告株系進行正向遺傳學的大量篩選，也將幫助我們盡快地闡明這一機制的分子基礎。

植物中miRNA選擇翻譯抑制還是切割mRNA的決定因素，目前并不清楚。早期研究認為的影響因素（miRNA與靶基因結合的位置和互補配對的程度），目前看來都不能很好地解釋兩種機制產生的原因。miRNA介導的兩種作用機制背后，可能有一些其他原因。miRNA與靶基因在MBP上的富集表明切割和翻譯抑制是與翻譯過程相偶聯的，因此RISC復合體與mRNA的結合在某種程度上是與核糖體的一種競爭。靶基因上的核糖體密度，RISC復合體在細胞內豐度的高低是否會影響機制的選擇，都是未來非常值得探索的問題。植物miRNA不僅可以通過胞間連絲實現細胞之間的短距離擴散，還可以通過篩管進行長距離的運輸［88］。在miRNA產生的部位原位地和運輸到的遠程部位中miRNA對靶基因沉默的機制，是否存在差異，仍待進一步的闡明。當然，這兩種機制的選擇也許由更為復雜的因子綜合決定。除了miRNA、靶基因mRNA和miRNA剪切產物在MBP上的富集，翻譯抑制中關鍵的GW182橋梁因子在植物中的缺失，體內ribo-seq數據未顯示核糖體在剪切位點附近的異常堆積等發現；在對多個AGO1剪切缺陷突變的轉基因株系的研究中發現，個別miRNA靶基因在mRNA剪切活性被阻斷以后，其蛋白的翻譯抑制情況也受到了影響［20］。綜合以上發現，我們可以推測:翻譯抑制對某些靶基因來說可能是發生在內質網上的一種mRNA剪切，由于其發生的位點是在活躍翻譯的內質網機器上，使我們認為這是一種翻譯抑制的機制。

此外，對一些主要執行翻譯抑制功能的miRNA來說，在RISC復合體中AGO1的內切酶活性是如何被抑制的也不清楚。動物miRNA-RISC復合體中的AGO2蛋白存在各種翻譯后修飾，例如，AGO2不同氨基酸位點的磷酸化可以引起AGO2與miRNA或者靶基因結合能力的變化，以及翻譯抑制效率的增強［89］。此外，AGO2的二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）導致miRNA的抑制效應降低等等［89］。已知植物AGO1蛋白的翻譯后修飾在一些病毒與植物的互作中發揮重要作用。病毒中的沉默抑制因子，通常編碼能夠泛素化底物的F box蛋白，以宿主體內的沉默效應蛋白AGO1為底物進行泛素化。被修飾的AGO1蛋白隨之進入自噬體或者“泛素—蛋白酶體”降解途徑。此外在非病毒與植物互作背景下，研究者們也發現了F box蛋白編碼基因FBW2能夠負調控AGO1蛋白水平［90-91］，暗示AGO1蛋白泛素化修飾的廣泛存在。然而AGO1其他翻譯后修飾仍未有報道，這些修飾的存在與否，以及對 miRNA作用機制的選擇或者RISC復合體的沉默效應的影響，將是未來非常值得關注和討論的問題。

很多靶基因在植物中同時存在mRNA的剪切和翻譯抑制［8，11，92］。兩種作用方式之間的平衡和分子機制，也需要更多更深入的研究。動物中miRNA誘導的翻譯抑制是可逆的［93-95］。研究發現，已經進入加工小體的mRNA分子在人類細胞受到饑餓刺激時可以被重新招募到多聚核糖體上進行翻譯［93］。加工小體可以作為mRNA的一個臨時儲存場所，以保證可逆的翻譯抑制的解除，使細胞在響應外界脅迫時做出迅速的反應。植物中也有多個加工小體相關的基因參與了翻譯抑制，暗示植物中的翻譯抑制可能也是一個可逆的過程。因為剪切后的mRNA進入降解是一種不可逆的生理過程，翻譯抑制機制可逆性的存在將豐富miRNA-靶基因調控的層次。此前也有綜述中提到，可逆的翻譯抑制可能是植物應對環境脅迫的一種臨時響應［96］，盡管這個假設還沒有被相關研究證實。2012年在蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）被根瘤菌侵染的研究中，研究者們發現了miRNA及其靶基因上附著的核糖體存在動態變化［97］，該研究在一定程度上支持了這一假說。植物miRNA翻譯抑制與植物響應環境脅迫之間的關聯，未來仍然需要更多的研究證實。

相信實驗技術的不斷精進和基因組學的深入探索，必將推動miRNA作用方式分子機制研究的進步。我們期待miRNA及其他小RNA分子參與的表達調控機制的網絡逐步明晰，這將有利于我們進一步了解生物體內部的運作機制，促進miRNA技術在抵御逆境脅迫、病毒侵染等領域中的應用。