羊口瘡病毒重慶分離株008基因的原核表達及生物信息學分析

余遠迪，許國洋，張素輝，鄭 華，付利芝，楊 柳*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，為線性雙鏈DNA病毒，基因組大小為134～139 kb，該病毒基因組中間為大的中心編碼區，參與病毒的組裝和釋放；兩端為反向末端重復序列[1-2]。臨床上，病毒感染羊后以增生性炎癥為典型特征，表現為在羊的口唇、舌、鼻、乳房等部位開始出現紅斑，然后紅斑形成丘疹、囊泡，帶黃色乳脂狀的膿皰外表和結痂最后變得干燥，并且病毒能反復感染宿主[3]。近年來，隨著我國養羊業的不斷發展，羊口瘡在我國發生的病例相繼被報道[4]，當人接觸患病的羊或野生動物時容易感染本病，對養羊業發展和相關人群的健康構成一定威脅。【前人研究進展】羊口瘡病毒的毒力基因、與宿主嗜性相關的編碼基因及免疫調節基因定位于基因組兩側的末端區域[5]，該病毒末端部分基因的功能相繼被解析：抑制NF-κB轉運的ORFV002和ORFV121[6-8]，趨化因子阻遏蛋白ORFV112[9]，GM-CSF/IL-2抑制因子ORF117[10]，血管內皮生長因子蛋白ORFV132[11]，免疫調節因子白介素-10 ORFV127[12]，抗細胞凋亡因子ORFV125[13]，脫氧尿苷三磷酸酶，以及F-box-like錨定蛋白[14]等。已被證實錨定蛋白重復序列和F-box結構域蛋白廣泛存在于痘病毒中，大小在400～650個氨基酸之間[15]，并且病毒在感染宿主的早期表達F-box-like錨定蛋白[16-17]。【本研究切入點】重慶是西南地區養殖羊的主要地區，在臨床流行病學調查中，發現羊口瘡持續在重慶地區流行，該病已經影響重慶地區養羊業的發展。【擬解決的關鍵問題】進一步闡明008基因的特性，為探索008基因的功能和致病機制奠定基礎，本研究對該基因進行克隆，并利用大腸桿菌表達系統進行原核表達和生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 材料

羊口瘡病毒毒株由重慶市畜牧科學院獸醫獸藥研究所分離保存；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、原核表達載體pET-28a(+)、羊口瘡病毒感染羊陽性血清由重慶市畜牧科學院獸醫獸藥研究所保存；925-68047 IRDye?680RD 驢抗山羊 IgG二抗購自Li-cor化學免疫試劑公司；LB液體培養基和LB固體培養基購自；氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG、PrimeSTAR GXL DNAPolymerase、pMD 19-T Vector、T4連接酶、NdeI、HindIII、DL 2000 DNA Marker購自寶生物公司；DNA膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 根據已發表羊口瘡病毒008基因序列，合成一對引物：OFRV-008-F，5’-CATATGATGCTCTCGCGGGAGTCCGTCGTGATGGATC CGCCGGAAATTAC-3’；OFRV-008-R，5’-AAGCTTTCAGGGGCGGGTCAGCATGGC-3’(斜線部分為NdeI、HindIII酶切位點)。

1.2.2 008基因的擴增 以分離的羊口瘡病毒DNA為模板擴增，反應條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 90 s；72 ℃ 7 min；16 ℃ 保存，擴增產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物用OMEGA膠回收純化試劑盒進行純化回收。

1.2.3 008基因的克隆和重組表達載體的構建 將純化的PCR產物和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接，轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，挑取單菌落進行PCR鑒定。陽性菌落接種于含Kan(50 μg/mL)的LB液體培養基中過夜，用Omega小量質粒提取試劑盒提取質粒，NdeI、HindIII雙酶切鑒定。測序正確后將質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞中，挑取單個菌落并進行測序鑒定。

1.2.4 重組質粒的誘導表達及SDS-PAGE分析 將含有pET-28a(+)-008和pET-28a(+)空載體的E.coliBL21(DE3)工程菌分別轉接于含Kan (50 μg/mL)LB液體培養基中，200 r/min振搖培養過夜，次日按3∶100轉接于含Kan(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃振搖培養至OD600 nm≈1.5，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，分別于誘導后8、16、24 h取菌液10 mL。菌液在4 ℃以10 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用5 mL 滅菌水重懸后用超聲粉碎儀在冰上粉碎20 min(工作5 s，間隔5 s，功率300 W)，在4 ℃以10 000 r/min離心10 min。分離上清和沉淀，沉淀用5 mL滅菌水重懸。分別取上清液(含表達可溶部分)30 μl和重懸液(含表達非可溶部分，即包涵體)90 μl與上樣緩沖液混合，煮沸變性5 min，瞬時離心后加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 008蛋白的Western blotting分析 將重組表達的蛋白進行SDS-PAGE，用濕轉轉印儀進行轉移至NC膜上，轉膜儀置于冰上200 mA恒流轉膜50 min；用PBST洗滌NC膜，加入含5 %脫脂奶粉的封閉液37 ℃封閉2 h，棄去封閉液，PBST洗滌NC膜5遍，每遍3 min，加入羊口瘡陽性血清(1∶100)為一抗；驢抗山羊IgG為二抗(1∶10000)。使用Odyssey雙色紅外激光成像系統掃描NC膜觀察。

1.2.6 羊口瘡008蛋白生物信息學分析 使用ProtScale程序在線分析ORFV 008蛋白的疏水性；使用TMHMM server v.2.0對008蛋白進行跨膜區分析；使用SignalP 5.0 server對ORFV 008蛋白進行信號肽預測；使用Protean對008蛋白進行B細胞抗原表位預測分析。

2 結果與分析

2.1 008基因的擴增與克隆

以羊口瘡病毒基因組DNA為模板，通過PCR擴增出與預期大小(1500 bp)一致的片段(圖1)。目的基因經過純化后與pMD19-T載體連接，得到重組質粒pMD19-T-008，經酶切得到1500 bp左右的片段，測序結果與GenBank中的基因序列比較同源性達98.34 %，結果表明目的基因成功克隆。

M.DNA分子量標準；1.008基因擴增片段

2.2 pET-28a(+)-008質粒的鑒定

將pET-28a(+)質粒與pMD19-T-008質粒用NdeI、HindIII雙酶切后連接轉化置大腸桿菌BL21(DE3)中，構建得到重組表達質粒pET-28a(+)-008，挑取陽性單克隆進行PCR以及雙酶切鑒定，得到1 500 bp左右片段(圖2)，測序比對結果正確，結果表明重組原核表達質粒pET-28a(+)-008構建成功。

M.DNA分子量標準；1.pET-28a(+)-008質粒

2.3 重組菌的誘導表達及SDS-PAGE分析

取重組誘導菌不同誘導時間的菌體分別進行SDS-PAGE分析，試驗確定IPTG誘導16 h表達量最大，表達產物約為56 kd，與預期蛋白條帶相符，而未誘導菌和誘導后的空載體均未出現次蛋白條帶(圖3、圖4)。對超聲裂解細菌的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，表明重組蛋白以包涵體的形式存在。

M.蛋白分子量標準;1,5,pET-28a(+)空載體分別誘導8、16 h表達上清產物；2,6.pET-28a(+)空載體分別誘導表達8、16 h沉淀產物；3,7.pET-28a(+)-008蛋白分別誘導表達8、16 h上清產物；4.pET-28a(+)-008蛋白分別誘導表達8、16 h沉淀產物

M.蛋白分子量標準;1,pET-28a(+)空載體誘導表達上清產物；2,pET-28a(+)空載體誘導表達沉淀產物；3.pET-28a(+)-008蛋白誘導表達上清產物；4.pET-28a(+)-008蛋白誘導表達沉淀產物

2.4 008蛋白的Western blot鑒定

用羊口瘡陽性血清(作為一抗，IRDye驢抗山羊IgG作為二抗)對未純化的包涵體蛋白進行Western blot分析，結果表明原核表達的008重組蛋白能跟羊口瘡陽性血清特異性結合(圖5)，結果表明008重組蛋白具有良好的抗原性。

2.5 008蛋白生物信息學分析

使用ProtScale程序基于K-D法在線分析ORFV 008蛋白的疏水性，結果可知008蛋白大約在C端位置含有一個典型的疏水性區域(圖6)，親水性平均系數(GRAVY)為0.209；使用TMHMM server v.2.0對008蛋白進行跨膜區分析，預測結果顯示，008蛋白1～516位氨基酸位于細胞膜表面，氨基酸殘基系數為1.37，不具有明顯的跨膜結構；使用SignalP 5.0 server對ORFV 008蛋白進行信號肽預測，結果顯示008蛋白不具有信號肽序列(圖7)；使用Protean對008蛋白進行B細胞抗原表位預測分析，采用Kyte-Wolf的親水性方案、Karplus-Schulz的柔韌性方案、Emini的表面可及性方案和Jameson-Wolfde 抗原指數方案綜合預測(圖8)，各方案所得到的抗原表位見表1。

表1 單參數方案預測的抗原表位

圖6 ProtScale程序分析008蛋白的疏水性

圖7 SignalP對008蛋白的信號肽預測

圖8 008蛋白綜合預測結果

3 討 論

目前，國內關于羊口瘡病毒的致病機制還了解較少，該病毒的一些基因特性尚未解析。已被證實錨定蛋白重復序列和F-box結構域蛋白廣泛存在于痘病毒中，早期的研究表明，F-box-like錨定蛋白利于羊口瘡病毒的復制[18]，F-box蛋白可通過泛素-蛋白酶體系統介導多種蛋白質的降解，能將底物募集到細胞SCF(SKP-1、c ullin、F-box)泛素連接酶復合物上[19-20]；牛痘病毒編碼的ANK/PRANC蛋白CP77是一個宿主范圍蛋白，與NF-κB轉錄因子p65相互作用，抑制炎性細胞因子的轉錄[21]；鼠痘病毒編碼的含有4個F-box-like錨定蛋白和BTB/Kelch蛋白質，分別通過調節泛素連接酶活性阻止IκBα的降解，抑制NF-κB的核轉運[22]；此外，羊口瘡病毒錨蛋白上調缺氧誘導因子(HIF)靶基因的表達從而影響細胞的缺氧信號轉導通路[23]，羊口瘡病毒的F-box-like/ANK錨定蛋白通過不同的方式參與病毒致病的途徑，而008蛋白屬于該家族成員，相關的研究甚少，其在病毒與宿主的互作中發揮的作用需要進一步挖掘。

通過SDS-PAGE分析，構建的重組表達質粒在IPTG的誘導下成功表達了008蛋白，對表達蛋白的抗原性分析結果表明，重組蛋白具有良好的抗原性。分析ORFV 008蛋白的疏水性，可知008蛋白大約在C端位置含有一個典型的疏水性區域，疏水性氨基酸存在于蛋白質內部，通過其疏水的相互作用，在保持蛋白質三級結構的形成和穩定中起著重要作用；使用TMHMM server v.2.0對008蛋白進行跨膜區分析，預測結果顯示，008蛋白1～516位氨基酸位于細胞膜表面，氨基酸的殘基系數為1.37，不具有明顯的跨膜結構，提示它可能在膜受體沒有起作用；在信號肽預測中，008蛋白前60個氨基酸中跨膜螺旋中的氨基酸殘疾數值為0.0002，該蛋白無信號肽剪切位點；經過對親水性指數、抗原指數和表面可能性指數的篩選，排除α螺旋、β折疊內不易形成表位的序列，位于β-轉角、無規則卷曲處的表位42～47、78～81、129～137、152～156、181～186、228～231、238～244、294～299、339～342、353～357、365～368預測區域較有可能為B細胞抗原表位，但也不排除其他區域或者它們的附近也存在B細胞抗原表位，其他區域是否存在還需進一步的確認。

4 結 論

本研究克隆羊口瘡病毒008基因，并將其插入pET-28a(+)載體中成功構建原核表達質粒，成功表達008蛋白；并對其生物信息學進行了分析，為進一步探索羊口瘡病毒008蛋白在感染宿主過程中的機制和作用奠定基礎，豐富羊口瘡病的致病機制提供科學數據，也為羊口瘡病毒基因的研究開發提供新的靶標。