烤煙黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分的分離及應(yīng)用

鐘 軍，楊 爽，周 田,2， 戴林建*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.貴州省六盤水市六枝特區(qū)扶貧開發(fā)局，貴州 六盤水 553600)

【研究意義】烤煙黑脛病在我國煙區(qū)發(fā)生較普遍，致使每年的經(jīng)濟損失非常嚴重[1-3]。因此，開展黑脛病菌致病效果的研究，對現(xiàn)代烤煙產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。【前人研究進展】目前防治烤煙黑脛病最常用的方法是化學(xué)防治[4-6]；此外，利用拮抗內(nèi)生細菌[7-14]、生防菌劑[15]、殼聚糖[16]、植物提取物[17-19]、基因工程[20]等生物防治方法也獲得了較好的抗病效果；然而自1972年Carlson[21]第一個分離出耐野火病的烤煙突變體后，利用突變體獲得抗病烤煙的研究得到了迅速發(fā)展。何云昆等[22]利用葉片懸浮培養(yǎng)篩選出了抗野火病的烤煙新品系；王荔等[23]用黑脛病粗毒素作為選擇壓，利用烤煙花粉獲得6個高抗黑脛病的細胞突變株系；其他研究者也均有通過培養(yǎng)黑脛病病原菌作為選擇壓來篩選抗突變體的報道[24-25]。在烤煙黑脛病的防治途徑中，抗病品種的篩選和培育是最有效的途徑，而利用粗毒素或致病活性組分篩選烤煙抗病材料已成為遺傳育種的有效補充，越來越受到科研工作者的重視。【本研究的切入點】本論文利用篩選出的黑脛病菌發(fā)酵液致病活性組分在細胞水平上(花藥)進行烤煙高鉀新品系抗黑脛病突變體的篩選，將再生植株進行抗性鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問題】以期為早期篩選抗病材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烤煙高鉀新品系由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)戴林建自育的經(jīng)質(zhì)子誘變的HKDN-8，田間綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良但抗病性差；黑脛病菌(0號生理小種)，由湖南省烤煙公司永州分公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑脛病菌發(fā)酵液的制備和致病力的檢測 將分離提純的黑脛病菌菌種分別接種于燕麥、V8、馬鈴薯、煙葉汁和胡蘿卜5種固體培養(yǎng)基中(置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)1周)，待其菌絲長滿后再分別轉(zhuǎn)入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中(置于28 ℃、220 r/min的搖床中)；于培養(yǎng)的第5～7 天，收集無菌發(fā)酵液后經(jīng)過4 ℃、8000 r/min離心15 min，將上清液經(jīng)0.22 μm細菌過濾器過濾除菌后備用[26]；最后，采用離體葉片注射法，取200 mL發(fā)酵液接種于離體煙葉上，觀察記錄烤煙葉片注射區(qū)的HR反應(yīng)，以此檢測黑脛病菌發(fā)酵液的致病力[27]。

1.2.2 黑脛病菌發(fā)酵液活性組分的分離 取發(fā)酵液依次通過5 KDa微濾和3 KDa超濾中空纖維素膜，得到超濾液；然后將超濾液經(jīng)D101型大孔吸附樹脂處理后用95 %乙醇將樹脂上吸附的成分沖下，得到乙醇洗脫液(發(fā)酵液活性組分)。

1.2.3 黑脛病菌發(fā)酵液活性組分的應(yīng)用檢測 將消毒的烤煙材料花藥接種于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，設(shè)置6種處理，黑脛病菌發(fā)酵液活性組分的濃度分別為：M0處理，0 %；M1處理，1 %；M2處理，2 %；M3處理，3 %；M4處理，4 %；M5處理，5 %，每處理6個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種25顆花藥，檢測花藥的萌發(fā)情況以確定最適選擇壓濃度。花培植株抗黑脛病性的檢測和鑒定：同1.2.1中的“黑脛病菌發(fā)酵液致病力的檢測”。以上研究于2015-2016年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的作物生理與分子生物學(xué)教育部重點實驗室進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑脛病菌發(fā)酵液的培養(yǎng)效果

由圖1可知，與培養(yǎng)0 d(對照，CK)相比，黑脛病菌在V8培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)5～7 d后獲得的發(fā)酵液已使葉片注射區(qū)出現(xiàn)輕微凹陷狀，伴有白色圈點；但總體上煙葉均未出現(xiàn)明顯HR壞死斑現(xiàn)象。

圖1 黑脛病菌發(fā)酵液在V8培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

由圖2可知，在胡蘿卜培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 d(對照，CK)和5 d，無HR反應(yīng)；培養(yǎng)6～7 d，白色斑點增多、面積擴大、并伴隨著注射區(qū)煙葉大范圍凹陷；但未產(chǎn)生明顯HR壞死斑現(xiàn)象。

圖2 黑脛病菌發(fā)酵液在胡蘿卜培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

由圖3可知，在燕麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 d(CK)的，煙葉無HR反應(yīng)；培養(yǎng)5 d，伴有白色斑點出現(xiàn)；培養(yǎng)6 d，白色斑點較大；培養(yǎng)7 d，煙葉注射區(qū)產(chǎn)生黃色斑點，雖然有HR反應(yīng)但不顯著。

圖3 黑脛病菌發(fā)酵液在燕麥培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

由圖4可知，在煙葉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 d(CK)的，煙葉未產(chǎn)生HR反應(yīng)；培養(yǎng)5～7 d，使煙葉注射區(qū)出現(xiàn)白色凹陷，伴有白色斑塊，部分斑塊存在變黃的現(xiàn)象，但也未出現(xiàn)明顯HR壞死斑。

圖4 黑脛病菌發(fā)酵液在煙葉汁培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

由圖5可知，在馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)0 d，煙葉無明顯損傷；培養(yǎng)5 d，煙葉有輕微壞死斑并伴隨著小范圍黃色斑點出現(xiàn)；培養(yǎng)7 d，煙葉出現(xiàn)明顯抗敏感性壞死斑，即產(chǎn)生HR反應(yīng)。

圖5 黑脛病菌發(fā)酵液在馬鈴薯培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

由表1可知，馬鈴薯培養(yǎng)基是誘導(dǎo)黑脛病菌發(fā)酵液致病效果最佳的培養(yǎng)基，同時黑脛病菌發(fā)酵液需要培養(yǎng)7 d以上，其致病效果才能明顯表現(xiàn)出來。

表1 黑脛病菌發(fā)酵液在5種培養(yǎng)基中的HR反應(yīng)

2.2 黑脛病菌發(fā)酵液活性組分的致病性

由圖6～7表明，與黑脛病菌發(fā)酵液原液(C1)的HR反應(yīng)相比，黑脛病菌發(fā)酵液超濾液(C2)可使煙葉病斑面積平均值達0.87 cm2，HR壞死斑反應(yīng)明顯，二者間差異達到1 %的顯著水平；與C1和C2的HR反應(yīng)相比，乙醇洗脫液(C3)使煙葉的病斑面積平均值達0.93 cm2，HR反應(yīng)的壞死斑更明顯，與C1之間呈1 %的差異，而與C2之間呈5 %的差異；這說明C3的致病性最強。

圖6 黑脛病菌發(fā)酵液不同活性組分的煙葉壞死斑面積差異

圖7 黑脛病菌發(fā)酵液不同活性組分的煙葉HR反應(yīng)

2.3 黑脛病菌發(fā)酵液活性組分的應(yīng)用

由圖8～9可知，乙醇洗脫液濃度為1 %和4 %時，萌發(fā)率分別為16.0 %和6.7 %，與2 %～3 %(10.7 %、9.3 %)處理間的差異呈極顯著；說明2 %～3 %為篩選HKDN-8抗黑脛病突變體的最適選擇壓。

圖8 不同選擇壓濃度下烤煙花藥抗黑脛病突變體的萌發(fā)率

圖9 烤煙花藥抗黑脛病突變體最適選擇壓的篩選

圖10～11表明，經(jīng)過2 %～3 %黑脛病菌發(fā)酵液活性組分篩選出的成活花藥進行離體培養(yǎng)后的再生植株，其烤煙植株對黑脛病性的抗性分別達到了高抗(HR)和中抗(MR)；而經(jīng)過4 %黑脛病菌原液篩選出的，對黑脛病性的抗性為高感(HS)，說明本試驗中乙醇洗脫液(黑脛病菌發(fā)酵液活性組分)對篩選烤煙抗黑脛病突變體是有效可行的。

H.R表示高抗；M.R表示中抗

H.S表示高感

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯培養(yǎng)基是培養(yǎng)烤煙黑脛病菌的最佳培養(yǎng)基，與前人的“燕麥培養(yǎng)基是較適于烤煙黑脛病菌生長的培養(yǎng)基”結(jié)果[28]不一致，這可能與培養(yǎng)基性質(zhì)不同有關(guān)，具體原因還有待于從培養(yǎng)基成分對病菌致病力的影響方面進行進一步的分析。

雖然黑脛病菌原液與超濾液均可使煙葉產(chǎn)生HR壞死斑，但乙醇洗脫液使煙葉產(chǎn)生的HR反應(yīng)更為明顯，這說明黑脛病菌致病因子主要存留在乙醇洗脫液中，可用做抗病突變體篩選的致病因子，但還未見有關(guān)于烤煙黑脛病菌致病活性組分分離和致病能力的報道。

如果培養(yǎng)基中乙醇洗脫液(黑脛病菌發(fā)酵液活性組分)的濃度過低，雖然花藥的成活率較高，但不能起到抗病選擇壓的作用；濃度過高，則導(dǎo)致花藥壞死；因此，致病因子最適選擇壓的確立是篩選抗病突變體植株的關(guān)鍵。本文的結(jié)果表明分別利用研究已確定的最適選擇壓(2 %～3 %乙醇洗脫液和4 %原液)篩選出的花藥培養(yǎng)再生植株，前者處理的植株對黑脛病性的抗性分別達到了高抗(HR)和中抗(MR)而后者處理的發(fā)病率較高(HS)，說明黑脛病菌發(fā)酵液乙醇洗脫液(致病活性組分)對篩選烤煙抗黑脛病突變體是有效可行的，可以作為烤煙早期黑脛病抗性鑒定的手段。