基于云南主栽馬鈴薯品種抗氧化防御系統對干旱脅迫的響應研究

任家慧，楊 淼，王 玥，黃 鈺，李 潤，胡錦飆，肖關麗

(云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】馬鈴薯具有耐貧瘠、產量高、適應性廣、經濟效益高等特點，是中國第四大糧食作物[1-2]。干旱是影響植物生長的重要環境因素之一，嚴重時會導致植株死亡，造成不可逆傷害[3-4]。植物對干旱脅迫的響應策略一直是抗旱生理的研究熱點。正常條件下，植物體內的O2對植物沒有危害，而當植物處于干旱條件下，O2可形成1O2，或逐步被還原成超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基[5-6]。超氧陰離子易通過自身歧化反應或通過SOD催化生成H2O2，逆境脅迫下植物體內大量積累H2O2，當活性氧濃度超出防御機制所及范圍時，細胞將處于氧化脅迫狀態，對植物有機體極為有害[7]。馬鈴薯種植始終會遭受不同程度干旱的影響，影響馬鈴薯產量和塊莖質量[8-9]。因此，研究馬鈴薯在干旱脅迫下抗氧化防御機制的響應對馬鈴薯抗旱栽培及育種具有重要意義。【前人研究進展】植物在響應干旱脅迫時，體內活性氧平衡被打破，會通過酶促和非酶促抗氧化防御系統來消除活性氧的傷害，干旱脅迫下植物體內H2O2含量隨脅迫時間延長或脅迫程度的增加而升高[10-11]，還原性抗壞血酸(AsA)，還原性谷胱甘肽(GSH)含量隨干旱脅迫程度增加，呈先升后降的變化趨勢，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性顯著高于對照，隨脅迫時間的延長或脅迫程度的加劇先升后降，而單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)的變化在不同物種間有差異[12-14]。有關馬鈴薯對干旱脅迫的響應有不少研究報道，干旱脅迫會影響馬鈴薯的農藝性狀、葉綠素含量、細胞滲透調節物質、光合效率、葉綠素含量及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等酶活性變化，但針對馬鈴薯抗氧化防御系統尤其抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環對干旱脅迫響應的系統研究報道較少[15-17]。【本研究切入點】植物抗氧化防御系統對干旱脅迫的響應已經成為植物抗旱生理評價的重要內容，也是抗旱作物篩選的重要依據。云南冬春干旱頻發，云南主栽馬鈴薯品種抗氧化防御系統對干旱脅迫響應有必要進行系統研究。【擬解決關鍵問題】本研究采用PEG-6000模擬不同程度干旱脅迫，研究其對馬鈴薯抗氧化防御系統中酶性及非酶性物質的影響，為探明干旱脅迫對馬鈴薯抗氧化防御系統生理機制提供參考，為馬鈴薯抗旱栽培及育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種合作88號、青薯9號、麗薯6號、宣薯2號，種薯購自于云南省尋甸六哨農業綜合服務中心。

1.2 試驗設計

本試驗于云南農業大學后山大棚進行盆栽試驗。選擇大小一致的馬鈴薯種薯播種，每個品種播種30盆，每盆2株。出苗后20 d進行PEG模擬干旱脅迫處理，設PEG6000濃度為0 %(CK)、15 %、20 %、25 %、30 % 5個處理梯度。脅迫3 d后，取各品種馬鈴薯倒4葉、倒5葉進行各項指標測定，3次重復。

1.3 相關物質及酶活性測定方法

對供試驗樣品中類胡蘿卜素(Car)、還原性抗壞血酸(AsA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、可溶性蛋白(SP)、過氧化氫(H2O2)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽還原酶(GR)進行測定，所有指標均采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒進行測定。

1.4 數據分析

利用Excel 2010進行數據整理，SPSS 19.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對馬鈴薯葉片過氧化氫及可溶性蛋白含量的影響

2.1.1 干旱脅迫下馬鈴薯葉片過氧化氫含量 從圖1可以看出，在PEG濃度為15 %～30 %的模擬干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中H2O2含量隨著干旱程度的增加而增加，其中在PEG濃度 15 %輕度干旱脅迫下，合作88號、青薯9號、麗薯6號和宣薯2號葉片中H2O2含量均較對照明顯增加，其含量分別為(3.66±0.03)、(1.88±0.08)、(1.29±0.07)和(1.80±0.01)μmol/g，4個品種間差異顯著(F=6.59，P<0.05)。在PEG濃度 30 %的高度干旱脅迫下，葉片中H2O2含量達到最大，其中合作88號、青薯9號、麗薯6號和宣薯2號葉片中H2O2含量分別為(1.80±0.01) 、(2.84±0.01) 、(4.12±0.02) 和(5.23±0.01) μmol/g，4個品種間差異顯著(F=8.63，P<0.05)，與PEG濃度0 %(CK)相比，4個品種葉片中H2O2含量分別增加了719.57 %、333.90 %、425.44 %和79.60 %。綜合來看，PEG濃度15 %～30 %的干旱脅迫下馬鈴薯葉片H2O2含量，均表現為合作88號>青薯9號>宣薯2號>麗薯6號。在供試的4個品種中，合作88號過氧化氫(H2O2)積累量最大，氧化脅迫程度最高。

同一濃度數據上不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。下同

2.1.2 干旱脅迫下馬鈴薯葉片可溶性蛋白含量 圖2結果表明，在PEG濃度15 %～30 %的模擬干旱脅迫下，馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量呈先增加后降低的趨勢變化，其中PEG濃度15 %～25 %的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量隨著PEG濃度的上升而增加，在PEG濃度30 %時較PEG濃度 25 %時可溶性蛋白含量下降，供試合作88號、青薯9號、麗薯6號和宣薯2號葉片中可溶性蛋白含量分別為(0.07±0.01) 、(0.13±0.01) 、(0.06±0.01) 和(0.13±0.02) μmol/g，較PEG濃度25 %的干旱脅迫下上述4個品種馬鈴薯葉片可溶性蛋白的含量分別降低了63.16 %、27.78 %、83.78 %和27.78 %。由此表明，在較低PEG濃度的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中可溶性蛋白含量隨著干旱脅迫程度的增加而增加，但在較高PEG濃度的干旱脅迫下，馬鈴薯葉片中可溶性蛋白含量會急劇降低，對干旱脅迫的防御調控作用下降甚至喪失。

圖2 干旱脅迫條件下馬鈴薯葉片內可溶性蛋白含量

2.2 干旱脅迫對馬鈴薯葉片中抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，在PEG濃度15 %、20 %、25 %和30 %處理下，4個馬鈴薯品種葉片中抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性隨著PEG 濃度的增加呈先增加后下降的變化趨勢，即在15 %～20 %濃度范圍內，3種酶活隨PEG濃度的增加而增加，但當PEG 濃度超過20 %后，這3種酶活即下降，當PEG 濃度達30 %時，抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)酶活降為最低，4個品種分別為 (55.16±11.17) 、(32.05±3.33) 、(71.77±3.56) 和(53.95±0.31) μmol/g，(171.46±3.08) 、(172.57±2.85) 、(131.86±3.10) 和(276.65±2.47) μmol/g。脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)于PEG 濃度達30 %時降為最低，4個品種分別為(484.74±13.69) 、(443.88±16.12) 、(438.73±6.67)和(545.25±2.75) μmol/g。單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的酶活隨著PEG 濃度的增加呈先下降后增加的變化趨勢，即在15 %～20 %濃度范圍內，2種酶的酶活隨PEG濃度的增加而降低，但當PEG 濃度超過20 %后，這2種酶的酶活即增加，當PEG濃度達25 %時，單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)酶活達最高，4個品種葉片的酶活分別為(477.86±8.93) 、(465.91±3.53) 、(348.11±8.47) 和(356.27±5.15) μmol/g。當PEG濃度達20 %時，谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)酶活達最高，4個品種葉片的酶活分別為(16 730.02±140.00) 、(15 629.97±121.60) 、(16 494.97±135.10) 和(10 852.28±52.90) μmol/g。

圖3 干旱脅迫下馬鈴薯幼苗期葉片抗氧化酶活性變化

從不同濃度PEG干旱脅迫下各供試馬鈴薯品種葉片中各酶活峰值期來看，在脅迫后酶活峰值時合作88號葉片中抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性明顯高于其他品種(F=9.68，P<0.05)，宣薯2號葉片中脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)含量顯著高于合作88號(F=6.87，P<0.05)、麗薯6號(F=7.35，P<0.05)和青薯9號(F=8.32，P<0.05)。在脅迫后單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)峰值時，合作88號、青薯9號和麗薯6號品種葉片中單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)間無明顯差異(單脫氫抗壞血酸還原酶：F=7.43，P<0.05)；谷胱甘肽過氧化物酶F=8.29，P<0.05)。

2.3 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質含量的變化

由表1表明，隨干旱脅迫程度的增強，馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質含量的變化趨勢不盡相同，其中抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)呈現先升高后下降的變化趨勢，而類胡蘿卜素Car含量呈持續升高的變化趨勢。對于干旱脅迫下葉片中抗壞血酸的含量，在濃度25 % PEG的脅迫下，含量達峰值，合作88號、青薯9號、麗薯6號和宣薯2號葉片酶活分別為(0.21±0.01) 、(0.22±0.01) 、(0.97±0.01) 和(0.93±0.03) μmol/g，其中合作88號和青薯9號間無顯著差異(F=0.15，P>0.05)，麗薯6號和宣薯2號間無顯著差異(F=0.31，P>0.05)，但麗薯6號和宣薯2號葉片中抗壞血酸含量顯著高于合作88號(F=6.32，P<0.05)和青薯9號(F=7.43，P<0.05)。對于谷胱甘肽GSH含量，在PEG濃度25 %的脅迫下，谷胱甘肽GSH酶含量達峰值，4個品種葉片該酶含量分別為(1.78±0.01) 、(2.46±0.02) 、(1.78±0.01) 和(1.96±0.03) μmol/g；其中青薯9號葉片中谷胱甘肽GSH含量高于其他幾個品種，但差異不顯著(F=0.49，P>0.05)。對于類胡蘿卜素Car含量，在PEG濃度30 %的脅迫下，類胡蘿卜素Car含量達峰值，4個品種葉片類胡蘿卜素Car分別為(481.67±0.32) 、(485.21±2.18) 、(491.64±0.12) 和(490.41±0.20) μmol/g；其中青薯9號葉片中類胡蘿卜素Car含量高于其他幾個品種，但差異不顯著(F=0.21，P>0.05)。

表1 干旱脅迫下馬鈴薯幼苗期葉片非酶性抗氧化物含量

3 討 論

3.1 干旱脅迫造成馬鈴薯葉片中過氧化氫含量上升

干旱是馬鈴薯生產中的主要限制因子，干旱脅迫下，植物體內活性氧動態平衡被破壞，大量活性氧和自由基積累。過氧化氫(H2O2)具有較強的氧化性，可直接氧化一些酶類的疏基，使酶失去活性；還可與超氧陰離子反應生成破壞性更強的單線態氧，對植物的生理活動產生嚴重影響[5-7]。本研究發現，隨PEG濃度的增加，馬鈴薯葉片內過氧化氫含量呈逐漸上升趨勢，表明干旱脅迫下馬鈴薯受到氧化脅迫，且干旱程度越大，氧化脅迫程度越明顯，這與刑更生研究山黧豆幼苗中H2O2等含量的變化結果一致[18]。本研究還表明，不同馬鈴薯品種在干旱脅迫下受到的氧化脅迫程度有異，其中在干旱脅迫下合作88號馬鈴薯葉片內過氧化氫積累量高于青薯9號、麗薯6號和宣薯2號，表明合作88號馬鈴薯品種對干旱脅迫具有較強的耐受性。

3.2 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中的可溶性蛋白含量發生變化

植物在干旱脅迫下會增加滲透調節物質的含量以維持植株的正常生長發育，可溶性蛋白作為植物體內主要的滲透調節物質，在植物應對干旱脅迫時可以維持植物與環境的滲透平衡[15,17]。干旱脅迫下，植物可溶性蛋白含量升高或降低均有研究報道[19-20]，本研究中可溶性蛋白含量隨干旱脅迫程度的增加呈現出先升高后降低的變化趨勢，PEG濃度 25 %處理，馬鈴薯葉中可溶性蛋白含量最高，相比PEG濃度 0 %(CK)，麗薯6號變幅最大，合作88號變幅最小，這與陳浩維等研究玫瑰花瓣的結果一致[21]。說明在干旱脅迫時，不同的馬鈴薯品種可通過增加葉片中可溶性蛋白的合成調節細胞滲透壓，以維持植物正常的生理活動及生長發育，但不同馬鈴薯品種間存在差異。

3.3 馬鈴薯葉片中非酶性抗氧化物質對干旱脅迫產生積極響應

抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素(Car)均為植物逆境條件下重要的非酶性抗氧化劑，對植物清除活性氧起到了至關重要的作用[22]。AsA在植物體內共有4條合成途徑和一條再生途徑，其中再生途徑是植物體清除活性氧的主要途徑，不僅能夠作為APX的底物清除H2O2，還可作為抗氧化劑，歧化H2O2，還原超氧陰離子，猝滅單線態氧。本研究表明，隨干旱脅迫程度的增加，馬鈴薯葉片中AsA呈先上升后下降的變化趨勢，但均明顯高于對照，這與鄭清嶺[23]等人報道的沙芥的研究結果相一致。GSH和AsA均為植物體內高豐度小分子抗氧化物質，能直接清除活性氧，也可通過AsA-GSH循環清除H2O2，本研究結果表明GSH的變化趨勢與AsA類似。類胡蘿卜素是氧化脅迫下，能保護葉綠體免受傷害的一類非酶性抗氧化劑，本研究發現，類胡蘿卜素含量在輕度干旱脅迫(PEG濃度15 %)時含量上升，中度干旱脅迫(PEG濃度20 %～25 %)含量略有下降但仍高于對照，重度干旱脅迫(PEG濃度30 %)含量上升。前人研究中發現，干旱脅迫下，植物體的類胡蘿卜素含量變化趨勢不盡相同，含量升高、含量降低、先升高后降低、先降低后升高的結果均有報道[16,24]。Car變化趨勢不一致的原因可能是由于植物抵御干旱脅迫的能力不同，葉綠體損傷程度不同，從而導致Car變化不一致，物種和品種間差異較大。

3.4 干旱脅迫下馬鈴薯葉片中各抗氧化酶活性發生不同程度變化

抗壞血酸過氧化物酶(APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、谷胱甘肽還原酶(GR))、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是植物體內AsA-GSH循環中的關鍵酶，在干旱脅迫下，對植物清除H2O2具有重要作用[25-26]。APX和DHAR、MDHAR是AsA再生途徑的關鍵酶，APX以AsA為電子供體催化H2O2分解形成H2O和O2，減輕對植物的傷害，DHAR則利用GSH作為電子供體，將對植物有害的DHA還原為AsA，從而起到清除H2O2再生AsA的作用，MDHAR與DHAR和GSH共同協調作用維持植物體內AsA水平[26]。GR作為重要的抗氧化酶類，其主要作用是將氧化型谷胱甘肽還原為GSH，從而促進AsA-GSH循環，清除植物體內過量的H2O2，降解氧化物起到對植物的保護作用。GPX在抗氧化防御系統中主要起到清除脂類和烷基過氧化物的作用，也可與GSH協同清除H2O2。

有研究報道表明，隨干旱脅迫強度的增加和時間的延長，植物體內對APX、MDHAR、DHAR、GPX、GR活性變化不同，如大豆、玫瑰、水稻等植物在中度干旱脅迫時APX、DHAR、GPX活性最強，MDHAR活性隨干旱脅迫程度增大而升高或無明顯變化[14,20-21]。本研究發現，隨干旱脅迫程度增加，4個馬鈴薯品種葉片中的APX、GR和DHAR均有不同程度的上升，而MDHAR在脅迫程度較低，即PEG濃度為15 %和20 %時，含量低于對照，之后隨脅迫程度上升，含量上升并顯著高于對照。究其原因，可能在輕度干旱脅迫時，APX、DHAR和GR即起到清除過氧化氫的作用，但對MDHAR有一定抑制作用，所以MDHAR含量低于對照，但重度干旱脅迫時，MDHAR參與到清除過氧化氫的過程中，所以含量上升。因此，各種酶類在不同植物中的協同防御干旱的生理機制還值得進一步探究。

4 結 論

在干旱脅迫下，馬鈴薯通過抗氧化防御系統對干旱脅迫及時作出響應，其體內各類抗氧化酶及非酶性物質相互協調發揮作用，從而維持其正常生長發育。隨干旱脅迫程度增加，馬鈴薯葉片中H2O2含量持續增加，抗氧化防御系統受激發，APX、GPX和DHAR的活性增加，馬鈴薯植株體內AsA、GSH含量上升，協同緩解干旱所造成的傷害。中度干旱脅迫時馬鈴薯葉片中的抗氧化酶活性最強，AsA、GSH、Car和SP的含量最高，清除H2O2能力最強。此外，合作88號馬鈴薯在輕度和中度干旱下適應性相對較強，較適合于干旱年份種植。