西藏河谷區紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體的篩選

田 麗，王富強，湯繼旺，葉彥輝,2，陳文峰，金 濤，彭 君，邵小明*

(1.中國農業大學資源與環境學院/生物多樣性與有機農業北京市重點實驗室，北京 100193；2.西藏農牧學院，西藏 林芝 860000；3.中國農業大學根瘤菌研究中心，北京 100193；4.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009；5.西藏自治區農牧科學院農業研究所，西藏 拉薩 850032)

【研究意義】西藏是青藏高原的主體，平均海拔4000 m以上，素有“世界屋脊”和“地球第三極”之稱，是青藏高原生態安全屏障的核心區域[1]。但近幾十年來，青藏高原作為全球氣候變化的敏感區之一，加之西藏生產、旅游等人為活動的加強，以及對牲畜需求的穩定增長，導致西藏草地退化嚴重，草畜矛盾明顯增加[2]。推廣人工牧草種植已經成為緩解這一矛盾的有效途徑，也是西藏自治區政府重點關注的民生工程之一[3]。在人工牧草種植中，豆科植物一直是牧草中的重要類群，它不僅可以飼草，還可以通過共生固氮來獲取空氣中的N，增加土壤肥力，提升豆科牧草的產量和營養品質[4]。西藏主栽的多年生豆科牧草紫花苜蓿(Medicagosativa)分布廣，不同海拔、不同氣候類型下紫花苜蓿的生長狀態各不相同，如何通過接種根瘤菌以減少化肥投入并提高產量？根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，它能侵染豆科植物的根部形成根瘤，將大氣中分子態氮轉化成植物可吸收利用的化合態氮，作為回報，根瘤菌可在受保護的環境中獲得碳水化合物[5]。根瘤菌與其寄主植物之間平衡穩定的內生聯系為提高寄主植物在植物生命周期中的表現提供了一種可持續的途徑[6]。研究表明，紫花苜蓿與根瘤菌不同菌株間具有一定的選擇性[7]，同一菌株接種不同的紫花苜蓿品種，或同一品種用不同菌株接種，都會出現不同的共生效果，而且彼此差異較大[8]。另外，任何對根瘤菌或寄主植物的生長發育產生負面作用的環境因子，諸如溫度、降水、土壤養分、鹽堿度、含水量、pH等都可能對共生固氮產生影響[9-10]?！厩叭搜芯窟M展】國內外有關紫花苜蓿和根瘤菌的研究已有很多報道[11-14]，但西藏的根瘤菌研究僅限于采集、分類等[15]，對于不同區域是否需要不同菌株以達到減肥增效作用尚未有報道。西藏地域遼闊，不同地區海拔、氣候、土壤等條件差異較大，而同種根瘤菌在不同地區的固氮效果往往存在較大差異?！颈狙芯壳腥朦c】為了篩選出適合西藏河谷區的紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體，本研究在西藏的林芝、拉薩、日喀則3地開展了紫花苜蓿與5個苜蓿中華根瘤菌菌株的田間匹配試驗?！緮M解決的關鍵問題】以期為西藏不同氣候下紫花苜蓿的高效生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

林芝試驗地位于林芝市巴宜區八一鎮唐地村(94°21′E，29°41′N，海拔2900 m)，屬溫暖濕潤季風氣候。年平均氣溫8.8 ℃，最冷月平均氣溫為-2 ℃，最熱月平均氣溫20 ℃，無霜期160～180 d，年日照時數2022 h，年平均降水量650～750 mm，主要集中在5-9月份，占全年降水量的90 %左右。土壤母質主要是沖積、洪積母質，質地偏沙，土質較好。

拉薩試驗地位于拉薩市達孜縣章多鄉曲尼巴村(91°36′ E，29°48′ N，海拔3744 m)，屬高原溫帶半干旱季風氣候。年平均氣溫7.5 ℃，最高氣溫28.1 ℃，最低氣溫-16.5 ℃，無霜期100～120 d左右，年降水量為450 mm，主要集中在6-9月份，全年日照時數3000 h以上，太陽輻射強，晝夜溫差大，冬春寒冷干燥且多風。試驗地土壤為砂壤土，質地較松散。

日喀則試驗地位于日喀則市拉孜縣曲下鎮拉曲村(87°38′E，29°07′N，海拔3970 m)，屬高寒干旱氣候。年平均氣溫6.9 ℃，最高氣溫為25.6 ℃，最低氣溫為-16 ℃，無霜期226 d，年降水量為329.9 mm，其中6-9月降水量占全年的90 %以上。氣候干旱少雨，夏涼，冬寒，日照強烈，冬春季少雨雪多大風，風力較大，持續時間長。試驗地土壤為砂石土，質地較粗，土層較薄，保水和保肥能力差，蒸發量極大。

各試驗地土壤理化性質見表1。

表1 試驗地土壤理化性質

1.2 試驗材料

從表2可知，供試植物：中蘭2號紫花苜蓿(Medicagosativa‘Zhonglan No.2’)，凈度96 %，發芽率(86±3) %，適應性強，在西藏3個地點都生長良好，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供；供試菌株：苜蓿中華根瘤菌(液體型)，由中國農業大學菌種保藏管理中心(Culture Collection of Beijing Agricultural University,CCBAU)提供。

表2 供試菌株及采集地

1.3 小區設計及管理

試驗分別于2018年5月29日、6月1日、6月5日在林芝、拉薩、日喀則無紫花苜蓿種植史的試驗地進行。以5株苜蓿中華根瘤菌為研究材料對中蘭2號紫花苜蓿進行田間小區試驗，以不接種根瘤菌的處理為對照(CK)，采用隨機區組試驗設計，每個處理3個重復，共54個小區，小區面積為8 m × 10 m，間隔0.5 m。播種前深耕，采用人工條播的方式播種，播深2～3 cm，行距25 cm，播種量為15 kg/hm2。在需要接種根瘤菌的紫花苜蓿小區中，播種前用含活菌數不少于109mL-1液體菌劑充分拌種；在生長期根據實際情況適當除草、灌溉，并于2018年10月5日、10月8日、10月12日對林芝、拉薩、日喀則3個地區進行取樣。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 牧草產量 分別在3個地區的試驗小區選取生長較為均勻區域，隨機沿行方向選出1 m長的樣帶，用剪刀離地面約5 cm剪取紫花苜蓿，去除雜草后稱鮮重。將稱完的鮮草帶回實驗室在105 ℃條件下殺青30 min，然后在80 ℃條件下烘干至恒重并測量干重。

1.4.2 土壤理化性質 在各試驗小區中，利用土壤取樣器進行表層土(0～15 cm)取樣。每個小區各取5鉆，然后將土壤混合作為該小區的土樣。將土壤樣品帶回實驗室后，在陰涼通風條件下陰干磨細，收集保存，用于測定土壤理化性質。其中，土壤pH采用電位法測定，土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定[16]，銨態氮含量采用凱氏半微量定氮法測定[17]，硝態氮含量采用紫外分光光度法測定[17]。

1.5 數據處理

采用Excel 2010進行數據整理，運用SPSS 20.0進行單因素方差分析(one-way ANONA)，用最小顯著性差異法(Least-Significant Difference,LSD)進行多重比較，采用GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 個試驗地各菌株接種效果比較

牧草產量是反映接種效果的一個重要指標。由圖1表明，在不同地區接種根瘤菌不同菌株對中蘭2號紫花苜蓿產量的影響是不同的。

不同字母表示同一地區不同處理間差異顯著(P<0.05)

在林芝地區，中蘭2號接種根瘤菌CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU01290和CCBAU85104的處理與CK相比顯著提高了紫花苜蓿的鮮、干草產量(P<0.05)，其中干草產量分別增產130.2 %、113.7 %、101.6 %、97.4 %，而處理CCBAU85213與對照相比無顯著差異(P>0.05)。因此，在林芝試驗地中，根瘤菌CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU01290和CCBAU85104均可達到增產效果，且根瘤菌CCBAU85240接種效果最好。

在拉薩地區，中蘭2號接種根瘤菌CCBAU01290、CCBAU85104、CCBAU85240和CCBAU85109的處理與CK相比顯著提高了紫花苜蓿的鮮、干草產量P<0.05)，其中干草產量分別增產92.7 %、87.0 %、53.1 %、40.3 %，而處理CCBAU85213與對照相比無顯著差異(P>0.05)。因此，在拉薩試驗地中，根瘤菌CCBAU01290和CCBAU85104能夠與中蘭2號高效共生，并實現顯著增產(P<0.05)。

在日喀則地區，中蘭2 號接種根瘤菌CCBAU85213、CCBAU85104的處理與CK相比顯著提高了紫花苜蓿的鮮、干草產量(P<0.05)，其中干草產量分別增產225.2 %、79.8 %，而處理CCBAU01290、CCBAU85109和CCBAU85240與對照相比無顯著差異(P>0.05)。因此，在日喀則試驗地中，根瘤菌CCBAU85213最適應當地的氣候和環境，與中蘭2號形成了較好的互利共生關系，促進其生長。

2.2 接種根瘤菌對土壤理化性質的影響

2.2.1 接種各菌株對林芝地區土壤理化性質的影響 從表3可知，在林芝地區接種各菌株后，處理CCBAU85104、CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU8 5213的全氮含量與CK相比均顯著增加(P<0.05)，增幅在28.5 % ～ 70.8 %；土壤銨態氮含量在組間無顯著差異(P>0.05)；在土壤硝態氮指標上，處理CCBAU01290顯著高于CK(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；在含水量指標上，處理CCBAU85104、CCBAU01290顯著高于CK(P<0.05)；在pH指標上，除處理CCBAU85213外，其他各組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 林芝地區接種根瘤菌后土壤理化性質變化

2.2.2 接種各菌株對拉薩地區土壤理化性質的影響 從表4可知，在拉薩地區接種各菌株后，所有處理根際土壤全氮含量與CK相比均顯著增加(P<0.05)；在銨態氮指標上，處理CCBAU01290顯著高于CK(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；在硝態氮指標上，處理CCBAU85240、CCBAU85109顯著增加(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；在含水量指標上，各組間無顯著差異(P>0.05)；在土壤pH指標上，處理CCBAU85213、CCBAU85240、CCBAU01290顯著高CK(P<0.05)。

表4 拉薩地區接種根瘤菌后土壤理化性質變化

2.2.3 接種各菌株對日喀則地區土壤理化性質的影響 從表5可知，在日喀則地區接種各菌株后，根際土壤全氮含量在各組間差異顯著(P<0.05)，組間排序為CCBAU85213>CK>CCBAU85240> CCBAU85109> CCBAU85104> CCBAU01290，其中處理CCBAU85213高于CK 20 %；在銨態氮指標上，除處理CCBAU85213顯著高于CK(P<0.05)外，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；在硝態氮含量上，處理CCBAU85109、CCBAU85240顯著高于CK(P<0.05)，其他處理間無顯著差異(P>0.05)；在含水量指標上，所有處理與CK相比均顯著增加(P<0.05)，是CK的1.97～5.53倍；在土壤pH指標上，除處理CCBAU85213顯著低于CK(P<0.05)外，其他處理與CK相比無顯著差異(P>0.05)。

表5 日喀則地區接種根瘤菌后土壤理化性質變化

試驗結果表明，接種高效根瘤菌能顯著提高土壤全氮含量(P<0.05)，但對銨態氮、硝態氮和pH無顯著影響。日喀則地區氣候惡劣、土壤貧瘠，較林芝、拉薩而言接種根瘤菌后各菌株表現差異較大，除CCBAU85213菌株外，接種根瘤菌在不同程度上降低了土壤全氮含量?？梢?，在環境惡劣的地區，接種高效根瘤菌的作用會更加明顯。

2.3 影響中蘭2號牧草產量的相關性分析

從表6可知，對3個試驗點的平均溫度(6-10月份)、平均降水(6-10月份)、干草產量、土壤全氮、銨態氮、硝態氮、含水量、pH等指標進行相關性分析。溫度、土壤含水量和土壤pH與其他指標間均存在顯著相關關系(溫度與土壤全氮的關系除外)；干草產量與溫度、土壤含水量呈正相關關系，與土壤pH呈負弱相關關系。由此可見，溫度、土壤含水量和pH在很大程度上影響了苜蓿產量和土壤中的氮素含量。

表6 中蘭2號接種根瘤菌各指標的相關性分析

3 討 論

3.1 不同菌株在不同土壤環境下接種效果的比較

本試驗是在實驗室前人的工作基礎上選擇了5株采集自西藏或內蒙、結瘤能力、固氮能力、競爭能力強的高效根瘤菌菌株[18-19]。但是，3個地點的接種試驗表明，這5個菌株對中蘭2號紫花苜蓿的促生效果在不同地區表現不同。在林芝、拉薩、日喀則3個試驗地與中蘭2號紫花苜蓿最佳匹配的根瘤菌依次為：CCBAU85240、CCBAU01290和CCBAU85104、CCBAU85213。而且，在這3個土壤養分以及氣候條件有較大差異的種植環境中，篩選得到的最佳匹配菌株也各不相同，說明菌株受到環境的顯著影響，不同地區需要不同根瘤菌菌株。閆偉[20]在沙爾沁、海流圖、觀碾房3個試點區的根瘤菌田間篩選試驗中表明這3個地區與草原3號雜花苜蓿相匹配的根瘤菌分別是SJN、XT、HBH。這與本研究的所得的結論是一致的。

苜蓿和根瘤菌的共生關系受到寄主、根瘤菌和環境三因素共同影響，而不只是根瘤菌與苜蓿的相互對話[21]。因此，為了獲得最佳的增產效果，根瘤菌選用時需針對種植的生態環境和寄主植物兩方面因素選擇最佳匹配的根瘤菌[22-23]，只考慮與寄主關系很可能是田間接種效果不穩定的主要原因[24]。

此外，菌株CCBAU85213采集自日喀則，與其他菌株相比，更能適應其高寒干旱的氣候和相對貧瘠的土壤條件，能夠與中蘭2號高效共生，實現顯著增產?？梢?，在選擇針對某一地區的根瘤菌時，最有效的還是來自本區或條件相近的菌株。這一結果在對大豆和紫花苜蓿的相關研究中也得到了相同的結論[25-26]。

值得注意的是，在日喀則地區表現最佳的菌株CCBAU85213在林芝、拉薩地區雖然沒有起到顯著增產的作用，但也說明在選擇根瘤菌劑時要注意菌株的地域適應性，在某一地區表現優異的菌株并不一定適合于其他地區，尤其是在不同地區氣候、土壤條件差異明顯的青藏高原，因此關于這一方面仍需開展深入研究。

3.2 影響接種效果的環境因素

根瘤菌與豆科植物之間的相互作用由于不利的土壤和氣候等因素而變得復雜。溫度、降水、土壤養分、鹽堿度、含水量、pH值等因素的波動對土壤微生物和植物的生長、存活和代謝活動及其共生能力有很大的影響[9]。相關性分析(表6)顯示，溫度、土壤含水量和pH在很大程度上影響了苜蓿產量和土壤中的氮素含量。研究表明，溫度是影響豆科植物生長、存活、結瘤和固氮的主要因素之一。一般而言，苜蓿根部溫度在22 ℃時，結瘤效果最好[27]；土壤水分也是影響固氮生物生理活動的重要因素，Serraj R[28]等人的研究表明，豆科植物-根瘤菌共生關系的形成及其活性對干旱十分敏感。當土壤水分嚴重缺乏時，固氮酶活性下降80 %～85 %[27]，從而抑制苜蓿-根瘤菌共生體系結瘤固氮，影響氮素的積累、降低植株高度和牧草產量[29-30]；土壤pH對苜蓿-根瘤菌的固氮效率有顯著影響，過高或過低的pH值都會對根瘤菌的生長有抑制作用，根瘤菌生長最適的pH 6.5～7.5[31-32]。苜蓿根瘤菌一般不耐酸，酸性土壤會降低根瘤菌與宿主植物之間的親和性，抑制根瘤菌的存活，從而使生物固氮受阻[32]；土壤環境中較高濃度的化合態氮(主要為硝態氮和銨態氮)會影響根瘤菌對根毛的侵染，降低結瘤數量，從而對其固氮效率表現出明顯抑制作用[27]。

林芝地區溫暖濕潤，養分較好，但其牧草產量卻不是最高的，可能是由于紫花苜蓿更喜溫暖半干旱氣候，且其最適pH 7～8[33]，而較強的土壤酸度和較高的氮素含量，在一定程度上了抑制了結瘤，降低了紫花苜蓿-根瘤菌共生體系的固氮效率和生物量；拉薩地區屬高原溫帶半干旱氣候，土壤偏中性，氮素含量較低，在接種根瘤菌后顯著提高了苜蓿產量，成為最高產的地區，說明在氮素營養缺乏的條件下接種根瘤菌是十分必要的；日喀則地區高寒干旱，鹽堿土質，土壤肥力差，除菌株CCBAU85213外，其他菌株并未表現出對中蘭2號明顯的促生作用，平均產量最低?？赡苁怯捎谠囼灥貧夂蚋珊?，蒸發量大，降低了水的活性，提高了植物根部滲透壓或加強了鹽脅迫[34]，從而抑制根瘤呼吸及光合作用產物向根瘤菌的供應以及根瘤菌的固氮活性和植物生長[24]。因此，如果限制因素限制了寄主豆科植物的活力，那么競爭和持久的根瘤菌株也將不能充分表達其固氮活性[35]。

此外，研究結果還發現，高效根瘤菌菌株接種后，在生長季中可提高土壤全氮含量。在林芝、拉薩和日喀則地區接種表現最佳的菌株CCBAU85240、CCBAU01290和CCBAU85104以及CCBAU85213與CK相比顯著提高了土壤全氮含量，但速效氮、含水量和pH有增有減?？赡苁怯捎诠潭ǖ牡匾约懊撀涞母龊偷蚵湮镌黾恿送寥廊浚@態氮和硝態氮可被植物吸收利用，導致土壤中速效氮含量增加不顯著。閆偉[20]的研究表明，接種根瘤菌對堿解氮有顯著提高，但對全氮含量無顯著影響。雖然這一結論與本研究并不一致，但都表明：在不同土壤環境中接種根瘤菌不僅對植物的共生固氮有直接作用，還會引起土壤微生物群落結構的改變，從而間接影響微環境。

4 結 論

紫花苜蓿-根瘤菌共生體系發揮高效共生作用受寄主、根瘤菌和環境的綜合影響。同一寄主植物在不同地區接種同一根瘤菌，其促生效果可能完全不同。

與中蘭2號紫花苜蓿最佳匹配的菌株：林芝地區是CCBAU85240，拉薩地區是CCBAU01290和CCBAU85104，日喀則地區是CCBAU85213。

相匹配的根瘤菌菌株接種后，在生長季中可提高土壤全氮含量。由此可見，在高寒區對紫花苜蓿接種高效根瘤菌可有效增加土壤肥力，對西藏人工草地建植、天然草地恢復具有重要意義。