煙草種子成熟過程的蛋白組學研究

李 勇，逄 濤*，鄭昀曄,，牛永志，師君麗，馬文廣,，盧秀萍

(1.云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 650021；2.玉溪中煙種子有限責任公司，云南 玉溪 653100)

【研究意義】種子質量是種子潛力的綜合表現，種子具有優良品質是保證發芽快速及出苗整齊和健壯的先決條件[1]。高質量種子具有明顯的生長優勢和生產潛力，對提高種子耐藏性和田間成苗率、抵抗苗期逆境、節省播種量、增加產量等具有重要意義[2-3]。種子質量與種子成熟度直接相關，只有成熟度達到要求的種子才有可能具有高活力[4]?！厩叭搜芯窟M展】目前，煙草種子成熟度主要依據蒴果和種子的顏色判斷，種子質量主要依靠發芽勢和發芽率判斷，在生化、分子方面的成熟機理研究尚未深入開展，煙草種子成熟度評價的內在指標缺乏[5]。煙草種子授粉后第27～33天采收的種子發芽率均可達90 %以上，但這期間不同采收時間的種子后期的活力和耐貯藏特性卻大不相同。因此，有必要在發芽率指標的基礎上開發其他指標(如種皮葉綠素熒光[6])指示種子成熟度和質量。蛋白質在種子形成、發育到長成幼苗的過程中均起著十分重要的作用[7]。蛋白質組學是一種從整體水平上研究蛋白質組成和調控規律的方法[8-9]。種子的蛋白組學分析是研究種子發育過程中基因表達的重要手段，但目前煙草種子蛋白方面的研究只有蛋白提取檢測方法研究[10]和個別蛋白在煙草種子發育過程中變化規律研究[11]的報道，未見煙草種子發育蛋白組學研究的文獻報道?！颈狙芯壳腥朦c】以同位素標記相對和絕對定量技術(iTRAQ)為基礎，對煙草種子成熟過程蛋白組的變化開展研究，篩選煙草種子成熟過程中的關鍵差異蛋白?！緮M解決的關鍵問題】為開發指示種子成熟度和質量的分子標記提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置、試劑及材料

色譜純甲醇購買于德國Merck公司，實驗用水由Millipore超純化系統制備。

AB SCIEX nanoLC-MS/MS(Triple TOF 5600 plus) (美國SCIEX公司)，配ChromXP C18分析柱(15 cm × 75 μm × 3 μm，美國SCIEX公司)，SB-50D超聲波提取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，MILLI-Q純水機(德國MILLIPORE公司)，Centrifuge 5804R離心機(德國Eppendorf公司)，CP2245分析天平(感量0.0001 g，德國Sartorious公司)，渦旋混勻器(荷蘭Breda公司)，CryoMill 磨樣機(德國Retsch公司)，CHRIST ALPHA 1-2/LD-Plus凍干機(德國Marin Christ 公司)。

使用的種子材料為烤煙品種云煙97。

1.2 蛋白提取及定量

取2 g煙草種子，液氮下磨成干粉(磨樣頻率30 Hz，磨樣時間30 s)，用200 μl的四乙基溴化銨裂解液(TEAB)溶解；超聲破碎15 min，離心(12 000 r/min)20 min取上清；加入4倍體積的冷丙酮(含10 mmol/L DTT，-20 ℃)沉淀2 h；離心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀；加入800 μl的冷丙酮；離心(12 000 r/min)20 min，收集沉淀于室溫下放置5～10 min，自然揮發掉殘留溶劑后存于-80 ℃備用?？偟鞍诐舛扔肂radford方法測定。

1.3 蛋白酶切、除鹽和標記

取1 mg/mL蛋白溶液100 μl，加入50 mmol/L NH4HCO3500 μl，加入2 μg Tryspin酶液，37 ℃過夜；取上述酶解液，加入等體積的0.1 % 甲酸酸化酶解液；取出Strata-X C18柱用1 mL甲醇活化，加入1 mL 0.1 % 甲酸平衡；連續過3次將上述酸化后的酶解液加入到Strata-X C18柱子中；加入1 mL 清洗液(0.1 % 甲酸+5 %乙腈)，清洗2次；取1個新的離心管，往Strata-X C18柱子中加入1 mL洗脫液(0.1 %甲酸+80 %乙腈)洗脫1次，收集洗脫液；凍干后用20 μl 0.5 M TEAB復溶。蛋白標記方法參考Itraq 8-plex reagent kit 說明書。

1.4 色譜質譜分析條件

色譜分析條件：色譜柱為ChromXP C18(15 cm × 75 μm × 3 μm)；A相為5 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸，B相為95 %乙腈水溶液添加0.1 %甲酸。線性梯度洗脫條件：0～65 min，B相由5 %上升至30 %，65～70 min，B相升至50 %，70～80 min，B相升至80 %，并維持5 min，85～85.1 min，B相降至5 %，并維持10 min；進樣量，5 μl。

質譜分析條件：采用正離子模式采集，采集范圍300～2200 m/z，采集頻率5 Hz。

1.5 蛋白質鑒定和定量

使用ProteinpilotTMV4.5進行蛋白鑒定并對鑒定結果進行人工過濾，將置信度大于95 %且至少包含一個特征肽段的蛋白設為可信蛋白，不符合該條件的蛋白不予統計；對于鑒定的肽段，置信度大于95 %的被認為是可信肽段，不符合該條件的肽段不予統計。

2 結果與分析

2.1 不同發育階段種子萌發率

通過對授粉后不同階段的煙草種子進行不同時間的萌發實驗(圖1)，發現授粉后第14天的種子完全不能萌發，授粉后第27和29天的種子在萌發14 d后基本達到成熟種子的萌發率，但相對成熟種子其萌發明顯滯后，而授粉后第31天的種子萌發率最高，是活力最高的成熟種子。

圖1 煙草種子在不同發育階段的萌發率

2.2 蛋白鑒定結果統計

授粉后第14、21、23、25、27、29、31、33天等8個時間節點種子樣品經液相色譜串聯質譜檢測到的所有二級譜圖數為269 818個，其中解析的二級譜圖數為83 852個，鑒定肽段數為14 316個，鑒定蛋白數為2852個。特征肽段統計結果顯示，所鑒定的2852個蛋白中1973個蛋白至少包含2個特征肽段，占總蛋白數的69.18 %。對所鑒定的肽段進行長度分析，結果表明所鑒定的多肽平均長度為13.48個氨基酸，處于肽段長度合理范圍。蛋白鑒定覆蓋度分析表明，鑒定覆蓋度在0 %～10 %范圍內的蛋白質所占比例為35.80 %，覆蓋度在10 %～20 %范圍內的蛋白占25.53 %，覆蓋度大于20 %的蛋白占38.67 %，所有蛋白的平均覆蓋度為20.07 %，這組指標與目前已報導的iTRAQ方法檢測蛋白質組研究中蛋白覆蓋度相似[12-13]。對于一個鑒定到的蛋白質，包含支持該蛋白的肽段越多，該蛋白的可信度就越高。實驗中符合標準的蛋白質鑒定覆蓋度表明鑒定結果的準確性較高。

2.3 差異蛋白篩選

以授粉后第14天的蛋白表達水平作為對照，分別對比第21、23、25、27、29、31、33天種子的差異表達蛋白，結果顯示在第21～27天隨著煙草種子發育差異表達蛋白數量逐漸增多，在第27～31天趨于穩定，而第31～33天差異表達蛋白數量迅速回落(表1)。這一結果與上述煙草種子不同階段的萌發率十分吻合，說明煙草種子成熟過程中，授粉后21～27 d可能是積累種子萌發所需結構蛋白和功能蛋白的關鍵階段，種子萌發率穩定上升，而27～31 d則可能是由功能蛋白調控代謝配置的階段，種子萌發率略有浮動。進一步對7組樣品間的差異表達蛋白進行聚類分析，從蛋白表達聚類看，蛋白整體表達量隨種子成熟過程逐漸變化，從樣本聚類看，授粉后31 d與29、33、27 d均有較大差異(圖2)。

表1 不同發育階段煙草種子差異蛋白統計

行代表蛋白聚類，列代表樣品聚類。所有定量數據經方差均一化處理

2.4 差異蛋白功能分析

為進一步研究煙草種子發育過程不同階段蛋白功能的響應，對每組樣品的差異表達蛋白進行相關基因功能注釋(gene ontology,GO)分析。結果顯示：授粉后第21和23天的差異表達蛋白顯著富集的功能都包括抗氧化活性、醛酮還原酶活性、結構分子活性等；授粉后第25、27、29天，差異表達蛋白顯著富集的功能則出現了酶抑制劑活性、作用于NAD和NADP的氧化還原酶活性、肽鏈內切酶抑制劑活性、碳-碳水解酶活性等；授粉后第31、33天，差異表達蛋白顯著富集的功能又增加了核苷激酶、核苷酸激酶等活性。由此可知，種子發育過程中其蛋白功能發生階段性變化，早期主要是執行種子形成的結構功能，中期主要負責種子生命活動的生化反應，而后期主要維持遺傳物質的動態平衡和穩定。

2.5 種子成熟度標記蛋白篩選

種子成熟度是種子品質的重要保障，只有適熟種子的發芽勢、發芽率和耐儲藏性等指標才會最優。而通過外觀判斷成熟度以指導采收常會出現主觀判斷失誤的情況，因此有必要在外觀判斷的基礎上開發成熟度相關分子標記。實驗共篩選出4個相關差異蛋白，他們在適熟期(授粉后第31天)之前表達量持續上升并在適熟期達到最高，隨后表達量急劇下降(圖3)。這些蛋白經進一步確認后可以單獨或組合起來開發相關定量檢測試劑盒，作為指示種子成熟度和質量的分子標記。

圖3 煙草種子發育過程中相關蛋白表達情況

3 討 論

實驗共檢測到269 818個肽段二級質譜圖，解析的二級譜圖數為83 852個，譜圖鑒定率為31.08 %，該鑒定率雖已達到同類研究的正常水平(如研究報導水稻種子應用iTRAQ技術總共鑒定2711個蛋白[14]，芥藍種子應用iTRAQ技術總共鑒定1532個蛋白[15])，但仍有69.92 %的譜圖信息未被解析。原因之一是種子樣品中蛋白含量差異很大，高豐度蛋白在檢測中會干擾低豐度蛋白的檢出，而低豐度蛋白通常二級質譜圖信號較弱、譜圖不完整，因此無法很好的進行譜圖匹配解析。其二是由于煙草種子蛋白組學研究較少，蛋白數據庫中沒有完整的待解析肽段的標準譜圖記錄，因此部分肽段無法解析。譜圖鑒定率低是蛋白組學研究面臨的共性問題，有待檢測技術的不斷發展和數據庫的不斷完善。

4 結 論

通過蛋白組學分析表明，煙草種子在發育的不同時期表達蛋白的功能不同，前期表達的主要為種子形成結構功能相關蛋白，中期主要為負責種子生命活動的生化反應相關蛋白，后期主要為維持遺傳物質動態平衡和穩定相關蛋白。研究篩選出6個相關蛋白，它們在種子發育前期表達量不斷上升并在適熟時期表達量達到最高，隨后表達量急劇下降。這些蛋白經進一步確認后可作為指示種子成熟度和質量的分子標記。