利用RNAi技術沉默稻縱卷葉螟膜結(jié)合型海藻糖酶基因

趙 鳳，杜 娟，李尚偉*，張澤杰

(1.貴州大學 昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.遵義市第十八中學，貴州 遵義 563000)

【研究意義】海藻糖是一種非還原性雙糖，由2個葡萄糖分子經(jīng)半縮醛羥基結(jié)合而成，廣泛存在于細菌、真菌、植物和無脊椎動物中[1-3]。在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下，海藻糖能在機體細胞表面形成獨特的保護膜，可有效保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持機體的生命過程和生物特征[4-5]。海藻糖在昆蟲體內(nèi)的唯一分解代謝途徑是在海藻糖酶(Tre)的作用下被水解為葡萄糖，葡萄糖最終作為細胞進行糖酵解的原料，為昆蟲的各種生命活動提供能量[6]。由于海藻糖在昆蟲生長發(fā)育中的重要性，其又被稱為昆蟲的“血糖”[7-8]。海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)唯一能水解海藻糖的酶類，在海藻糖代謝過程中至關重要，同時海藻糖酶也是幾丁質(zhì)合成通路中的第一個酶，在幾丁質(zhì)代謝過程中發(fā)揮關鍵作用。因此，海藻糖酶已經(jīng)成為防治害蟲的理想靶標。【前人研究進展】海藻糖酶(Tre)是昆蟲海藻糖代謝必不可少的一類酶，能專一催化1分子海藻糖水解為2分子葡萄糖。昆蟲中的海藻糖酶最先由Frerejacaque在1941年發(fā)現(xiàn)，隨后研究證實，昆蟲體內(nèi)存在2種類型的海藻糖酶，即可溶型海藻糖酶(Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(Tre2)。可溶型海藻糖酶主要存在于昆蟲消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，如血淋巴、中腸和馬氏管中，負責內(nèi)源性海藻糖的分解[9]；膜結(jié)合型海藻糖酶主要存在于昆蟲的肌肉中，其主要功能是水解食物中的海藻糖，從而為肌肉運動和取食階段中腸的運動提供能量[10]。海藻糖酶是由海藻糖酶基因編碼合成，海藻糖酶基因的表達和酶活性直接與蟲體正常發(fā)育、蛻皮、變態(tài)及繁殖等重要生理過程密切相關。1992年第一個可溶型海藻糖酶基因在黃粉蟲Tenebriomolitor中首次被克隆[9]，但第一個膜結(jié)合型海藻糖酶基因(CmTre2)直到2005年才在家蠶Bombyxmori中得以克隆驗證[11]。到目前為止，已經(jīng)有多種昆蟲的海藻糖酶基因被克隆，如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、西方蜜蜂Apismellifera[12]、甜菜夜蛾Spodopteraexigua[13-14]、灰飛虱Laodelphaxstriatellus[15]及飛蝗Locustamigratoria[16]等。【本研究切入點】水稻是世界上重要的糧食作物之一，無論是田間還是儲存過程中會受到多種害蟲的危害。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis，俗稱卷葉蟲、刮青蟲、苞葉蟲等，屬于鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae，是對水稻危害最嚴重的主要害蟲之一[17-18]。該蟲是一種典型的遷飛性害蟲，在我國和國外分布均廣泛[19]。稻縱卷葉螟主要危害水稻和玉米等禾本科作物，其幼蟲綴絲縱卷水稻葉片成蟲苞，幼蟲匿居蟲苞之中取食葉肉，使葉片僅留表皮，形成白色條斑，影響水稻光合作用，造成水稻秕谷增加，導致產(chǎn)量大幅下降[18]。化學防治因其防效好、收效快、使用方便等特點，目前仍是一項防治害蟲的主要措施，但大面積使用化學農(nóng)藥，容易造成農(nóng)藥殘留且殺傷天敵，導致害蟲產(chǎn)生抗藥性。迄今為止，一些關于利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術沉默害蟲靶標基因的研究[20-24]為害蟲的綠色防控展現(xiàn)出光明的前景。【擬解決的關鍵問題】運用RNAi技術沉默膜結(jié)合型海藻糖酶基因(CmTre2)的表達，定時觀察稻縱卷葉螟對水稻的取食情況、蟲體表型變化，并檢測靶標基因表達水平的變化及海藻糖酶活性變化，以期為進一步明確該基因在稻縱卷葉螟生長發(fā)育過程中的重要作用，以及利用RNAi防治該害蟲提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：稻縱卷葉螟由貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室飼養(yǎng)[25]，在人工氣候箱內(nèi)用稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度(26±1) ℃，相對濕度70 %～80 %，光周期14L:10D。

主要試劑與儀器：HP Total RNA Kit購自美國Omega Bio-Tek公司；TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit和GeneJET RNA Purification Kit購自美國Thermo Fisher公司；大腸桿菌EscherichiacoliJM109感受態(tài)細胞、DL2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit及LATaqDNA聚合酶均購于大連TaKaRa公司；pGEM-T Easy載體購于美國Promega公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix、Gel Extraction Kit和C1000 Thermal Cycler購自美國Bio-Rad公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；海藻糖酶活力測定試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司；顯微注射器、PCR耗材、離心管及其他常規(guī)試劑和耗材均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成及PCR產(chǎn)物測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 靶位點的設計 根據(jù)CmTre2的開放閱讀框(ORF)，通過3個在線RNAi寡核苷酸靶位點設計工具(http://siDirect2.RNAi.jp；http://biotools.idtdna.com/Scitools/Applications/RNAi/RNAi.aspx；http://optirna.unl.edu)，尋找具有較多Dicer酶切位點且無脫靶效應的靶標序列。用同樣方法在維多利亞多管發(fā)光水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(GFP)基因(GenBank：CAA58789)中設計1個靶標位點，作為對照。

1.2.2 引物設計 利用Primer Premier 6.0針對上述靶序列設計PCR引物和合成dsRNA所需引物，在合成dsRNA所需每條引物的5′端加上一段20 bp的T7啟動子序列，目的是使體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子能形成dsRNA。另外，根據(jù)CmTre2、稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因(CmCHSA)和幾丁質(zhì)合成酶B基因(CmCHSB)的ORF設計實時熒光定量PCR(RT-qPCR)引物，以稻縱卷葉螟看家基因CmActin(GenBank登錄號：JN029806)為內(nèi)參對照，檢測CmTre2、CmCHSA和CmCHSB的mRNA表達水平。引物信息見表1。

表1 稻縱卷葉螟膜結(jié)合型海藻糖酶基因的dsRNA合成引物和RT-qPCR引物

1.2.3 dsRNA的合成與注射 用表1中的引物對靶標序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后用膠回收試劑盒純化，回收產(chǎn)物進行TA克隆。然后用帶T7啟動子的引物按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo Fisher,USA)說明書分別合成CmTre2的dsRNA(dsCmTre2)和GFP的dsRNA(dsGFP)。體外轉(zhuǎn)錄體系：5×TranscriptAid eaction buffer 4 μl，ATP/CTP/GTP/UTP各2 μl，DNA模板(兩端帶T7啟動子)4 μl，TranscriptAid enzyme mix 2 μl，加Nuclease-free ddH2O補足至20 μl。在PCR儀中37 ℃反應5 h后，分別加入2 μl DNase I和RNase A，孵育15 min去除冗余的DNA及單鏈RNA，再分別加入2 μl EDTA終止反應。合成的dsRNA用GeneJET RNA Purification Kit(Thermo Fisher,USA)純化，使其濃度大于3 μg/μl。

將體外合成的dsCmTre2和dsGFP注射到稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)后，觀察生長發(fā)育的變化。選取大小一致、生長健康和發(fā)育良好的稻縱卷葉螟3齡幼蟲，沿著血液流動方向，分別在其腹部的8～10腹節(jié)間注射dsCmTre2，每頭蟲注射0.5 μl。以注射相同量dsGFP的稻縱卷葉螟作對照。每組設置3個重復，每個重復注射20頭蟲。分別將注射dsRNA和沒注射的幼蟲放在新鮮水稻葉片上，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察取食、表型及死亡情況。

1.2.4 沉默CmTre2及其對幾丁質(zhì)合成酶基因的影響 注射dsRNA后5 d，分別收集實驗組和對照組存活的幼蟲，提取總RNA，用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa,China)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。在C1000 PCR儀(Bio-Rad,USA)上進行RT-qPCR，分別檢測CmTre2、CmCHSA和CmCHSB的表達水平。用稻縱卷葉螟看家基因CmActin作為內(nèi)參對照。RT-qPCR采用2步法程序：95 ℃預變性1 min；第1步95 ℃變性10 s，第2步60 ℃退火和延伸20 s，共進行40個循環(huán)。反應后進行溶解曲線分析，以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染。每個樣本設3次重復。

1.2.5 海藻糖酶活性測定 稱取0.1 g經(jīng)dsRNA干擾后存活的稻縱卷葉螟，加入1 mL冷磷酸緩沖液，在冰上勻漿，4 ℃離心10 min，取上清液，用海藻糖酶活力試劑盒(蘇州科銘生物)進行海藻糖酶活力測定。以每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol葡萄糖作為一個酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用2-ΔΔCt法分析CmTre2、CmCHSA和CmCHSB基因mRNA在實驗組和對照組的相對表達量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0中方差分析(ANOVA)的Duncan氏新復極差法檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因CmTre2的沉默效應

RT-PCR結(jié)果顯示，稻縱卷葉螟在注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2的實驗組CmTre2mRNA相對表達量為0.463，注射dsGFP的對照組(CK)CmTre2mRNA相對表達量為1(圖1)。與對照組相比，實驗組CmTre2的表達水平較下降53.70 %，二者間差異達極顯著水平，表明dsCmTre2能有效降低CmTre2的表達。

* 和**分別表示差異達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平，下同

2.2 沉默CmTre2后稻縱卷葉螟的生長發(fā)育

注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2的實驗組幼蟲體型變小，蛻皮受阻，并出現(xiàn)畸形和死亡現(xiàn)象；注射dsGFP的對照組(CK)蟲體表型無明顯變化，生長發(fā)育情況良好(圖2)。注射dsRNA后5 d，注射dsCmTre2存活幼蟲的平均體重為22 mg，對照組的平均體重為24.87 mg，注射dsCmTre2的幼蟲體重顯著小于對照組(圖3)。表明，干擾膜結(jié)合型海藻糖酶基因的表達會導致稻縱卷葉螟不能正常生長發(fā)育。

圖3 注射dsRNA后5 d存活稻縱卷葉螟幼蟲的體重

圖2 沉默CmTre2基因5 d后稻縱卷葉螟幼蟲的表型變化

從圖4可以看出，注射dsRNA第2天時，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率為13.33 %，CK僅有1.667 %，兩者間的差異達顯著水平；第3天，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率為25.00 %，CK僅有1.667 %，兩者間的差異達極顯著水平；注射dsRNA 5 d后，注射dsCmTre2幼蟲的死亡率(51.67 %)是CK死亡率(3.33 %)的15.52倍。表明，沉默CmTre2能對稻縱卷葉螟引起顯著的致死效應。

圖4 注射dsRNA后稻縱卷葉螟幼蟲的死亡率

2.3 沉默CmTre2后幾丁質(zhì)合成酶基因基因的表達

從圖5可以看出，注射dsCmTre2 5 d后，幼蟲CmCHSA的mRNA相對表達量為0.858，與CK(dsGFP)相比下降不明顯；CmCHSB的mRNA相對表達量為0.6559，與CK相比下降34.41 %，達顯著水平。表明，注射dsCmTre2不僅對CmTre2具有明顯的沉默效應，對下游基因的表達也有不同程度的影響。

圖5 注射dsRNA 5 d后幾丁質(zhì)合成酶基因的mRNA相對表達量

2.4 RNA干擾海藻糖酶的活性

從圖6看出，注射dsCmTre2后5 d，稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活性為2364.5413 U，為對照組的64.36 %，與對照組相比具有顯著差異。表明，dsCmTre2對稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)海藻糖酶活力具有明顯的抑制作用。

圖6 注射 dsRNA 5 d 后稻縱卷葉螟幼蟲的海藻糖酶活力

3 討 論

RNAi是指在進化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。目前，可以通過飼喂、注射和轉(zhuǎn)基因等多種方法將體外合成的siRNA或dsRNA導入昆蟲體內(nèi)，其中，注射法是干擾效果最明顯的方法[26]。RNAi具有高效性和特異性，被廣泛應用于昆蟲領域的研究[27-30]。Chen等[14]的研究結(jié)果顯示，注射膜結(jié)合型海藻糖酶基因的dsRNA后，甜菜夜蛾S.exigua出現(xiàn)明顯的畸形個體，或進入下一期的幼蟲明顯小于正常個體，死亡率明顯高于對照組。該研究采用注射法成功將dsCmTre2注射入稻縱卷葉螟3齡幼蟲的腹部，結(jié)果顯示幼蟲生長發(fā)育受抑制，蟲體變小，體重減輕，死亡率大幅增加，膜結(jié)合型海藻糖酶基因表達水平顯著下調(diào)；而注射dsGFP的對照組，CmTre2的表達水平及幼蟲的生長發(fā)育和體重等均未受影響。該研究結(jié)果與Chen等[14-15]分別干擾甜菜夜蛾S.exigua和灰飛虱L.striatellus中的膜結(jié)合型海藻糖酶基因時顯示的結(jié)果相一致。

海藻糖是昆蟲的血糖，昆蟲的各個組織器官利用海藻糖時必須先利用海藻糖酶將海藻糖降解為葡萄糖。在昆蟲蛻皮及合成幾丁質(zhì)等各種生命活動中，都需要大量的海藻糖作為能源物質(zhì)為其提供能量。海藻糖酶活力的高低不僅影響海藻糖的降解，還與昆蟲血淋巴中糖類物質(zhì)的運輸效率密切相關，當昆蟲體內(nèi)海藻糖酶活力降低時，海藻糖去向減少，海藻糖含量升高，葡糖糖含量降低，血淋巴運送糖類物質(zhì)的效率降低，這不僅會影響昆蟲生長發(fā)育，還會影響幾丁質(zhì)的合成而產(chǎn)生致死效應[16,31]。在昆蟲體內(nèi)，海藻糖酶活性受多種激素的調(diào)節(jié)[32-34]。蛻皮激素可以提高海藻糖酶活力并加快海藻糖酶基因的表達[35-36]。滯育激素能提高家蠶B.mori卵巢海藻糖酶活性[37]。此外，當海藻糖酶基因的表達被干擾后，海藻糖酶活力也會降低。Zhao等[38]利用RNAi技術沉默褐飛虱Nilaparvatalugens海藻糖酶基因的表達，結(jié)果顯示注射dsRNA后海藻糖酶活力明顯降低，海藻糖酶含量增加，褐飛虱的生長受抑制。對稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)注射dsCmTre2后，CmTre2基因表達量降低，海藻糖酶活性降低，造成昆蟲發(fā)育受阻，體重降低。該研究結(jié)果與Zhao等[15,38]的研究結(jié)果相吻合。

海藻糖酶是昆蟲海藻糖代中的一個關鍵酶，亦是幾丁質(zhì)合成通路上的第一個酶，能催化海藻糖水解成葡糖糖作為能源物質(zhì)和合成幾丁質(zhì)的原料，幾丁質(zhì)的合成和降解對昆蟲的生長發(fā)育至關重要。近年來，甜菜夜蛾S.exigua、褐飛虱N.lugens和赤擬谷盜T.castaneum等多種昆蟲海藻糖酶-幾丁質(zhì)調(diào)控通路的研究結(jié)果均表明，海藻糖酶基因的表達對幾丁質(zhì)的合成與降解存在一定的調(diào)控作用。當海藻糖酶基因的表達被抑制后，海藻糖酶活力降低，海藻糖含量增加，葡萄糖含量減少，影響幾丁質(zhì)合成通路下游基因表達，幾丁質(zhì)代謝紊亂，導致昆蟲生長發(fā)育受阻[38-39]。昆蟲擁有可溶型和膜結(jié)合型2種類型的海藻糖酶，功能上存在差異，Tre1和Tre2分別調(diào)控昆蟲不同部位幾丁質(zhì)的合成。Tre1主要在血淋巴、中腸和馬氏管中高表達，負責內(nèi)源性海藻糖的分解；Tre2主要在脂肪體、中腸和馬氏管中高表達，負責外源性海藻糖酶的分解[40-41]。在甜菜夜蛾S.exigua的研究中，當SeTre1基因被干擾后，對幾丁質(zhì)合成酶A基因(CHSA)的影響較大，對幾丁質(zhì)合成酶B基因(CHSB)的影響很小；而SeTre2基因被干擾后，對SeCHSA基因的影響較小，對SeCHSB基因的影響較大[14]。該研究中，當CmTre2被干擾后，下游CmCHSB基因的mRNA表達量被顯著抑制，但對CmCHSA基因的表達影響較小，這可能與CHSA有可變剪切現(xiàn)象相關。Yang等[42]的研究結(jié)果表明，CHS1(CHSA)有2個可變轉(zhuǎn)錄本(CHS1a和CHS1b)，且CHS1a主要在表皮中表達，CHS1b主要在氣管中表達。在敲低CmTre2后，未檢測到CHSA表達量顯著降低，可能檢測的是CHS1a的mRNA表達量，下一步將針對此現(xiàn)象進行更深入的研究。Zhao等[38]將NlTre的dsRNA注射到褐飛虱N.lugens體內(nèi)，結(jié)果表明，在48和72 h后幾丁質(zhì)合成酶基因的表達量明顯下降。類似的研究結(jié)果在飛蝗L.migratoria等昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)[39]。此外，張露等[43]在研究褐飛虱N.lugens海藻糖酶基因調(diào)控幾丁質(zhì)代謝的過程中發(fā)現(xiàn)，上游海藻糖酶基因被干擾后，對下游部分幾丁質(zhì)酶基因的表達也有明顯抑制作用，幾丁質(zhì)含量下降，褐飛虱出現(xiàn)蛻皮困難等現(xiàn)象。上述研究結(jié)果表明，海藻糖酶對昆蟲幾丁質(zhì)合成和降解都有一定的影響，導致昆蟲體重減輕，生長受阻，甚至出現(xiàn)大幅死亡現(xiàn)象。

近年來，隨著昆蟲RNAi機制的闡明，科學家們在成功鑒定多種昆蟲基因功能的同時，將該技術用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的研究也取得了突破性的進展[44-45]。幾丁質(zhì)是昆蟲外骨骼、中腸和氣管等器官的重要組分，對昆蟲的生長發(fā)育至關重要。因此，明確幾丁質(zhì)合成相關基因在害蟲生長發(fā)育過程中的重要作用，將為深入發(fā)掘昆蟲致死基因作為RNAi的靶標提供理論依據(jù)。Arakane等[46]在赤擬谷盜T.castaneum的蛹和幼蟲血腔內(nèi)注射幾丁質(zhì)合成酶基因TcCHS1和TcCHS2的dsRNA，發(fā)現(xiàn)在幼蟲-幼蟲、幼蟲(蛹和蛹(成蟲3個階段，均可導致試蟲因蛻皮困難，無法擺脫舊表皮而致死。通過顯微注射的方法分別沉默G6PI和UAP基因，可分別致使桔小實蠅Bactroceradorsalis出現(xiàn)蛻皮困難的致死表型[47]。該研究通過RNAi干擾技術沉默CmTre2后，稻縱卷葉螟幼蟲生長發(fā)育受阻，體重減輕，出現(xiàn)畸形，最終因幾丁質(zhì)的合成受阻導致死亡，這與幾丁質(zhì)合成通路上的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶基因、幾丁質(zhì)合成酶基因的干擾現(xiàn)象[47-48]相似。

4 結(jié) 論

通過注射dsRNA到稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)，成功抑制了CmTre2的表達，海藻糖酶活力降低，幾丁質(zhì)合成受阻，導致稻縱卷葉螟生長發(fā)育受阻，體重減輕，出現(xiàn)畸形表型，最終導致死亡。該研究為進一步利用RNAi技術在田間防治稻縱卷葉螟奠定基礎，為該害蟲的綠色防控開辟新的領域。