低分子肝素的工藝技術(shù)研究

魏海濤 方秋華 張炳順 劉初亮 劉鑠佳

摘 要 肝素被用于醫(yī)學(xué)上對(duì)靜脈血栓的治療，是常用的天然抗凝物質(zhì)，但其易產(chǎn)生出血等副作用。低分子肝素可以很好地彌補(bǔ)肝素的不可控性，但我國(guó)目前對(duì)低分子肝素的研究尚未成熟，因此本次研究主要對(duì)各種不同的制備工藝技術(shù)進(jìn)行歸納總結(jié)，并通過(guò)分子量檢測(cè)和抗凝血活性檢測(cè)作為判定依據(jù)，為低分子肝素的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 肝素;低分子量;工藝技術(shù)

肝素是一種天然糖胺聚糖類(lèi)物質(zhì)，廣泛分布在哺乳動(dòng)物臟器內(nèi)，常與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，在醫(yī)學(xué)上當(dāng)作抗凝藥物使用。但低分子肝素受降解工藝的影響，降解后的化學(xué)結(jié)構(gòu)也會(huì)不同，進(jìn)而影響其藥代動(dòng)力學(xué)特征[1]。為了提供制備低分子肝素的理論依據(jù)，本次研究主要對(duì)所制備的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行簡(jiǎn)述，以及其幾種制備工藝技術(shù)的總結(jié)歸納和對(duì)比，并選取最優(yōu)制備方法進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，現(xiàn)將試驗(yàn)內(nèi)容總結(jié)如下。

1 肝素及低分子肝素的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 肝素的結(jié)構(gòu)與功能

肝素由兩種交替連接的糖醛酸和一種葡萄糖胺組成，這兩種糖醛酸以L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸的形式存在，另一種葡萄糖胺以α-D-葡萄糖胺的形式存在。在它們或其衍生物上可進(jìn)行硫酸化、乙酰化等的修飾，使肝素變得復(fù)雜可變。天然存在的肝素總分子量多在4～30KDa之間，大部分集中于12～15KDa間[2] 。

人體的血液之所以能夠自由流動(dòng)，依賴(lài)的是體內(nèi)的凝血與抗凝血系統(tǒng)。肝素可以加強(qiáng)或激活抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）的作用，從而延長(zhǎng)凝血時(shí)間。這里主要闡述肝素的抗凝血反應(yīng)機(jī)制。

1.2 低分子肝素的結(jié)構(gòu)與功能

低分子肝素由肝素經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物酶等方法降解得到，因此其結(jié)構(gòu)序列與肝素相似，但分子量會(huì)變小，一般為3～8KDa。除了具有肝素的功能以外，低分子肝素也用于普通抗凝劑所不適用的治療中，如彌散性血管內(nèi)凝血以及改善中風(fēng)引起的血液高凝狀態(tài)等。

2 低分子肝素的制備

2.1 物理法制備低分子肝素

物理方法包括超濾法、凝膠過(guò)濾法、乙醇沉淀法、色譜法、超聲波等，操作簡(jiǎn)單、高效可控，主要用于結(jié)構(gòu)的測(cè)定和生物活性的研究。物理法對(duì)低分子肝素結(jié)構(gòu)的破壞很少，但是普通肝素中含的低分子片段較少，取得率很低，所以物理法制備低分子肝素一般不用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 生物酶解法制備低分子肝素

生物酶解法使利用肝素酶的水解，將硫酸葡萄糖胺和硫酸艾杜糖醛酸之間的1，4-糖苷鍵斷裂形成末端殘基，該末端殘基在234nm處吸收值很高。目前為止生物酶解法的技術(shù)已相對(duì)成熟，反應(yīng)對(duì)環(huán)境無(wú)污染，但肝素酶的成本也比較高，一般不適宜應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 化學(xué)裂解法制備低分子肝素

化學(xué)裂解法所用的方法有多種，例如過(guò)氧化氫法、β-消除降解法和亞硝酸降解法等，它們的原理都是使肝素的糖苷鍵發(fā)生斷裂從而得到低分子肝素。其中亞硝酸法制備低分子肝素在工業(yè)化生產(chǎn)中更具優(yōu)勢(shì)，也是目前國(guó)際市場(chǎng)大多采取的方法。

（1）過(guò)氧化氫法

氧化物通過(guò)氧化作用使肝素中的糖苷鍵斷裂，制備出低分子肝素。同樣在一定溫度、酸堿度的條件下，可以制備出低分子肝素，但在生產(chǎn)過(guò)程中造成污染。

（2） β-消除降解法

β-消除降解法的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)控制其反應(yīng)條件，可以獲得較為均一的低分子肝素;參加反應(yīng)的試劑在最終產(chǎn)品中不存在。但缺點(diǎn)是工藝煩瑣，對(duì)技術(shù)要求高，成本高，穩(wěn)定性能也稍遜一籌。

（3） 亞硝酸降解法

亞硝酸降解法是將肝素在酸性條件下加入解聚劑，經(jīng)過(guò)一段反應(yīng)時(shí)間使糖苷鍵斷裂，再將pH值調(diào)至中性終止反應(yīng)。該法是目前制備低分子肝素使用的最廣泛的工藝技術(shù)，通過(guò)控制不同反應(yīng)條件，可有效降低肝素分子量。

3 低分子肝素的分析檢測(cè)

目前對(duì)低分子肝素的檢測(cè)手段有很多，主要使用高效液相色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核磁共振法、質(zhì)譜法等手段。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，它采用使試樣中各組分發(fā)生電離的基本原理，最后通過(guò)荷質(zhì)比進(jìn)行計(jì)算獲得結(jié)果。因亞硝酸降解法在工業(yè)化生產(chǎn)上最為常見(jiàn)，此處以亞硝酸降解法為例。

4 低分子肝素生物活性的測(cè)定

低分子肝素的抗凝血因子FXa與抗凝血因子FⅡa的活性效價(jià)受其分子量的影響，除此之外組成低分子肝素的單糖排列方式以及取代基的不同均可導(dǎo)致不同的生物活性。對(duì)于低分子肝素生物活性的最終判定以效價(jià)為指標(biāo)。詳細(xì)可見(jiàn)表1。

通過(guò)上表1的數(shù)據(jù)可知，低分子肝素與肝素的抗FXa生物活性相比變化幅度很小，這說(shuō)明經(jīng)亞硝酸降解法制備的低分子肝素能夠很好的保留其抗凝血活性;而低分子肝素的抗FⅡa的活性卻下降了許多，這說(shuō)明低分子肝素的安全性較肝素高，副作用有所減小。可信限率FL%是精密度的標(biāo)志，與肝素相比低分子肝素的可信限率更低，及可信度更高。數(shù)據(jù)顯示該法基本達(dá)到了制備低分子肝素的目的。

5 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)對(duì)幾種不同低分子肝素工藝技術(shù)的歸納，得知采用亞硝酸降解法制備低分子肝素最具可行性，且通過(guò)檢測(cè)結(jié)果可知其制備的低分子肝素能夠很好地達(dá)到制備目標(biāo)。因此今后在研究低分子肝素來(lái)源上和更高效的制備低分子肝素的工藝上，仍有許多值得我們探討的地方。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉欣悅.質(zhì)譜聯(lián)用新技術(shù)在低分子肝素藥物質(zhì)量控制方面的應(yīng)用[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2018.

[2] 黃滿紅.肝素的提取精制和亞硝酸法制備低分子肝素的研究[D].西安：陜西科技大學(xué)，2016.