耐鹽促生菌篩選、鑒定及對鹽脅迫小麥的效應

王 丹，趙亞光，張鳳華

(石河子大學/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832003)

土壤鹽漬化是世界性問題，全球鹽漬化土壤面積約為1×109hm2，而我國是世界鹽堿地大國之一，鹽漬化土壤總面積約為0.99×108hm2[1]。鹽堿地由于含有大量硫酸鹽、氯化物及重碳酸鹽成分，導致土壤板結硬化、透水性差、肥力下降等而使農作物減產[2]，已嚴重制約我國經濟及農業的可持續發展。極端高鹽、高堿環境導致動、植物難以生存，但卻蘊藏著大量的耐鹽堿、甚至嗜鹽堿的微生物類群[3-5]。這些微生物的生命活動在改變鹽堿地土壤理化性質的同時，也受土壤極端理化性質的影響，從而形成適應高鹽堿環境的細胞結構、遺傳特性和生理功能[6]。有些菌株除了具有耐鹽堿能力之外并具有固氮、溶磷(無機磷、有機磷)、分泌植物激素的能力。例如丁琳琳等[7]從鹽堿土中分離得到12株耐鹽堿菌，發現這12株耐鹽菌都具有產ACC脫氨酶、鐵載體及溶磷能力，產IAA。許芳芳等[8]和Dai等[9]分別對內蒙古荒漠植物根際土壤和寧夏荒漠草原土壤進行耐鹽堿細菌分離，發現所得耐鹽堿細菌兼具固氮、解無機磷、產鐵載體、產IAA、產ACC脫氨酶的功能特性。Komal等[10]從印度戈爾哈布爾鹽漬化土壤中分離篩選出一株陰溝腸桿菌，該菌株在鹽脅迫下可維持ACC脫氨酶活性，增溶磷酸鹽，產吲哚乙酸、鐵載體、氰化氫和胞外多糖。

小麥是全球主要糧食作物之一，鹽脅迫可直接導致小麥品質和產量下降[11]，Upadhyay等[12]和Pourbabaei等[13]研究表明，耐鹽芽孢桿菌能提高鹽脅迫小麥莖部及根系生物量。許芳芳等[8]將分離自荒漠地區的促生菌接種于鹽脅迫處理小麥，發現其對小麥莖鮮重和干重有顯著促進作用。李鳳霞等[14]將耐鹽促生菌株接種于小麥和燕麥種子，發現其對小麥、燕麥的根部具有明顯促生長作用。馬驄毓等[15]將從西藏阿里地區的披堿草根系及根際土分離篩選出的促生菌接種于披堿草，發現這些促生菌均在不同程度上增加了披堿草株高、根長及干重。趙龍飛等[16]研究發現，在250 mmol·L-1鹽脅迫下，接種內生菌的小麥幼苗POD和CAT活性較對照均顯著增加。以上研究表明，耐鹽促生菌可以緩解作物鹽毒害，對促進作物生產有著重要作用。因此，本研究擬從新疆瑪納斯河流域鹽堿土壤中分離耐鹽菌并將其接種于小麥，測定其在鹽脅迫下對小麥生長及生理特性的影響，以期為耐鹽促生菌的開發和小麥耐鹽脅迫栽培提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

土壤樣品采集地點位于新疆瑪納斯河流域沖積扇緣地帶十戶灘鎮(44°37′N，86°10′E)，地處準噶爾盆地南緣，常年干旱少雨，蒸發強烈，年降水量約為110～200 mm，年蒸發量達1 500～2 000 mm，年平均氣溫6.6 ℃，≥ 10 ℃積溫為 3 490 ℃，無霜期為148～187 d，屬于典型的大陸性氣候。于2018年4月以“五點法”進行取樣，取樣土層為0～20 cm，將采集土壤裝入無菌自封袋中，低溫保存迅速帶回實驗室。土壤類型為灰漠土，土壤基礎養分狀況見表1。

表1 供試土壤樣品基礎養分Table 1 Basic nutrient of soil samples tested

1.2 耐鹽菌的分離與篩選

稱取土樣10 g放入含有玻璃珠的無菌水中，充分振蕩使土顆粒分散，靜置片刻。取上清用無菌水進行梯度稀釋(1∶100；1∶1 000； 1∶10 000)后，吸取稀釋液100 μL于含120 g·L-1NaCl的LB固體培養基上，涂布均勻于 30 ℃培養一周后，將形態不同的菌落在新鮮LB固體培養基平板上純化，直至獲得細菌純培養物，并給菌株編碼。

1.3 菌株促生性能測定及篩選

菌株分泌IAA能力測定采用Salkowski比色液法[17]；溶磷能力采用鉬銻抗比色法培養2 d后測定[18]；鐵載體能力測定采用CAS檢測液法[19]；固氮能力測定采用點接阿須貝培養基法[20]。 根據被測指標篩選目標菌。

1.4 菌株最佳培養條件的確定

將所篩選目標菌株接種于LB 液體培養基中培養16 h(30 ℃，180 r·min-1)，作為種液。

1.4.1 最佳溫度的確定

將種液按1%接種量接種于pH為7.0的LB液體培養基中，分別于24、27、30、33、36、39 ℃條件下，180 r·min-1培養24 h，以不接菌為對照，測定菌懸液在600 nm處OD值，3個重復。

1.4.2 最佳 pH的確定

將種液按1%接種量分別接種于pH值為6、7、8、9、10、11的LB液體培養基中，在最適溫度條件下，180 r·min-1培養24 h，以不接菌為對照，測定菌懸液在600 nm處OD值，3個重復。

1.4.3 最佳 NaCl濃度的確定

將種液按1%接種量分別接種于NaCl濃度為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%的LB液體培養基中，在最適溫度、pH 條件下，180 r·min-1培養24 h，以不接菌為對照，測定菌懸液在600 nm處OD值，設置3個重復。

1.5 菌株形態、生理生化鑒定及菌株16S rDNA 序列分析

菌株形態觀察及生理生化鑒定參考東秀珠[21]方法；菌株16S rDNA 序列分析參考馬驄毓[18]方法。

1.6 小麥鹽脅迫濃度的確定

小麥品種為新春5號，由石河子大學綠洲生態農業重點實驗室提供。將清洗過的種子用0.1%的汞消毒5 min，并用無菌水沖洗5遍，用 5種不同濃度NaCl溶液(0、50、100、150、200 mmol·L-1)浸種8 h后，挑取大小均一的飽滿種子排列在鋪有濾紙的發芽盒(直徑12 cm)，3個重復，將其置于室溫黑暗條件下萌發24 h，然后于14 h/10 h的光/暗條件下培養，7 d后測定幼苗地上及地下部分鮮重，以確定盆栽鹽脅迫濃度。

1.7 菌株對鹽脅迫下小麥生長的效應

將清洗過的種子用0.1%汞消毒5 min，并用無菌水沖洗5遍，挑取大小均一的飽滿種子排列在鋪有濾紙的發芽盒(直徑12 cm)，待露白后，將3粒種子播種于300 g無菌土(營養土∶蛭石為 3∶1)的花盆(上直徑15 cm，下直徑10 cm，高13 cm)；向幼苗根部土壤中加入200 mL用1.6中確定的鹽濃度稀釋的菌懸液(108CFU·mL-1)，每隔5 d加菌懸液一次，以不接菌的同樣濃度鹽處理為對照，5個重復，于25±2 ℃的人工氣候室以14 h/10 h的光/暗條件培養，50 d后測植株株高、根長、株鮮重及根鮮重，并采用硫代巴比妥酸法測葉片脯氨酸(Pro)和根部丙二醛(MDA)含量[22]，用氮藍四唑光化還原法測定根系的超氧化物歧化酶(SOD)活性，用愈創木酚法測定根系的過氧化物酶(POD)活性[23]，采用紫外分光光度計法測定根系的過氧化氫酶(CAT)活性[24]。

1.8 數據處理與分析

采用Excel 2016進行數據處理及制圖表，采用 SPSS 20.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 耐鹽菌的分離篩選及其促生特性

利用含120 g·L-1NaCl的LB固體培養基，從所采集的鹽堿土壤樣品中初步分離出12株耐鹽菌，依次命名為wp-1、wp-2、…、wp-12。測定其生長特性及產吲哚乙酸(IAA)、鐵載體、溶磷、固氮能力后發現，wp-8在含L-色氨酸的LB培養基中生長48 h后，其 IAA分泌量為15.90 mg·L-1；無機溶磷量和有機磷溶量分別為1.10 mg·L-1和0.34 mg·L-1；鐵載體相對含量為0.68，接近0.5，說明其具有產鐵載體能力；不具有固氮能力。確定 wp-8為耐鹽高效促生菌。

2.2 菌株最佳培養條件的確定

2.2.1 最佳溫度的確定

由圖1可知，菌株wp-8在溫度為24～39 ℃培養時，菌液OD600值呈先升后降趨勢，以30 ℃時最大，且顯著高于其他處理，確定其為最適生長溫度。

圖柱上不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。下同。

2.2.2 最佳 pH的確定

由圖2可知，不同pH條件下，菌株wp-8菌液OD600值差異較大。當pH為6～11時，菌液OD600值隨 pH升高先增后減，pH為9時最大，pH為10與pH為9時的差異不顯著，確定最適生長pH為9～10。由此可知，wp-8在堿性環境下生長狀況較佳。

圖2 pH對菌株生長特性的影響

2.2.3 最佳 NaCl濃度的確定

由圖3可以看出，不同濃度NaCl對菌株wp-8生長影響較明顯。當NaCl濃度為4%～7%時，菌液OD600值均大于1.8，以在5%和6% 的值較大，二者差異不顯著；當NaCl濃度為7%～16%時，菌液OD600值下降趨勢明顯，當NaCl濃度為16%時，wp-8生長受到嚴重抑制或停止生長。說明菌株wp-8耐鹽范圍為4%～15%。

圖3 NaCl濃度對菌株生長特性的影響

2.3 菌株wp-8形態、生理生化鑒定及菌株16S rDNA 序列分析

菌株wp-8菌體形態為球狀，菌落直徑約為1.0～1.2 mm，呈淺黃色，邊緣整齊光滑，經革蘭氏染色確定該菌株為革蘭氏陽性菌。基于16S rDNA 基因序列片段比對(圖4)，菌株wp-8 與NesterenkoniarhizosphaeraeEGI 80099相似性達99%，表明其具有較高同源性，結合生理生化鑒定結果(表2)初步確定菌株wp-8為Nesterenkoniarhizosphaerae。

表2 菌株wp-8主要生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of wp-8

圖4 菌株wp-8 16S rDNA系統發育樹

2.4 最低鹽脅迫濃度的確定

不同鹽濃度處理小麥種子8 d后，幼苗鮮重結果如表3，在0～200 mmol·L-1鹽濃度脅迫下，隨著鹽濃度的增加，小麥幼苗植株鮮重和根鮮重呈下降趨勢。100 mmol·L-1與0 mmol·L-1處理間植株鮮重有顯著差異，但根鮮重無顯著差異，與50 mmol·L-1處理植株鮮重、根鮮重均無顯著差異。150 mmol·L-1、200 mmol·L-1處理較50、100 mmol·L-1處理植株鮮重和根鮮重顯著下降(P<0.05)，而150 mmol·L-1、200 mmol·L-1處理間無顯著差異。確定150 mmol·L-1NaCl為最低鹽脅迫濃度。

表3 不同鹽濃度處理對小麥幼苗株鮮重及根鮮重的影響Table 3 Effects of different salt concentrations on fresh weight of wheat seedlings g·plant-1

2.5 鹽脅迫下菌株wp-8對小麥幼苗生長特性的影響

由表4可知，150 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，wp-8菌懸液處理的小麥幼苗在生長至50 d時，其株高、根長、根重均顯著高于對照(P< 0.05)，株高增加2.83 cm，提高9.35%；根長增加6.00 cm，提高27.15%；根鮮重增加0.06 g，提高150.00%。株鮮重有所提高，但差異不顯著。說明菌株wp-8對小麥幼苗鹽脅迫具有良好的緩解效應，尤其對根系的發育。

表4 菌株wp-8對150 mmol·L-1鹽脅迫下小麥生長的影響Table 4 Effect of wp-8 strain on growth of wheat under 150 mmol·L-1salt stress

2.6 鹽脅迫下菌株wp-8對小麥幼苗生理特性的影響

由表5可知，鹽脅迫下接種菌株wp-8可顯著降低小麥幼苗根部MDA含量，較對照下降 29.55%，說明接種菌株wp-8可以明顯減緩鹽脅迫對小麥幼苗膜系統的傷害程度；Pro含量較對照顯著增加(P<0.05)，提高了10.03%，表明菌株wp-8能夠提高鹽脅迫小麥幼苗的脯氨酸含量。菌株wp-8處理小麥幼苗根部的SOD、POD、CAT活性均顯著高于對照(P< 0.05)，分別較對照提高160.63%、30.41%、44.93%，其中SOD活性增加程度最大。說明菌株wp-8能夠有效調節在一定的鹽脅迫條件下小麥幼苗的保護酶系統，推測可緩解小麥幼苗受傷害程度。

表5 菌株wp-8對150 mmol·L-1鹽脅迫下小麥生理特性的影響Table 5 Effects of wp-8 strain on physiological characteristics of wheat under 150 mmol·L-1salt stress

3 討 論

鹽脅迫是鹽堿地抑制植物生長、降低農作物產量的最常見非生物脅迫。從鹽堿地挖掘耐鹽促生菌種資源，利用其改良鹽堿土壤、促進植物生長是解決鹽堿地問題的有效途徑之一。大量研究表明，來源于鹽堿地的土壤微生物可以通過自身代謝產生植物激素，且具溶磷、固氮等促生特性[10, 25-26]。本研究從新疆鹽堿土壤中篩選出耐鹽度高達15%的菌株wp-8，該菌株具有部分促生特性，其吲哚乙酸分泌量為15.90 mg·L-1，鐵載體相對含量為0.68，溶有機磷及無機磷量分別為0.34 mg·L-1和1.10 mg·L-1，鑒定該菌為Nesterenkoniarhizosphaerae。

促生菌(PGPR)在鹽脅迫下通過誘導植物建立耐受機制，提高植物抗鹽性，促進植物生長。研究發現，將產IAA的假單胞菌接種于鹽脅迫下苗木種子后，芽長較對照增加52%，根長增加40%[27]。另外，IAA可以通過誘導 ACC 脫氨酶的活性，降低乙烯濃度，促進植物快速生長。將耐鹽陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)接種于油菜，發現油菜體內 IAA量增加而乙烯量減少[28]。部分PGPR自身含有ACC 脫氨酶，可分解乙烯合成前體ACC，使植物抵抗鹽損傷。將具耐鹽性的阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)接種于小麥，發現對小麥幼苗生長具有促進作用[29]。PGPR還可間接分泌鐵載體減緩植物在鹽逆境中毒害作用，同樣其溶磷性能也是促進作物生長重要因素之一，通過溶解土壤中難溶性磷，提高植物對磷的吸收。將溶磷量達424.85 g·mL-1促生菌RW8接種白三葉種子，可顯著增加白三葉幼苗鮮重和干重[30]。將具溶磷和產鐵載體能力的PGPR接種于檸條種子，發現能顯著促進檸條幼苗生長，尤其促進地下部的生長[31]。本研究發現，接種促生菌wp-8可顯著提高小麥幼苗株高、根長、根重(P<0.05)。小麥幼苗地下部分(根長和根鮮重)的增長率均高于地上部分，這與Glick[32]研究結果一致，可能因為植物根部是在逆境中直接感受信號的部位，菌株wp-8通過分泌植物激素IAA促進小麥根系延伸，使根系吸收更多營養物質進而促進地上部分生長[33]。推測小麥抗鹽性提高是菌株分泌生長素和溶磷能力的共同作用，但其促生作用是否與ACC 脫氨酶活性有關還有待研究。

鹽脅迫下植物體內產生活性氧、營養平衡遭到破壞、胞內紊亂、細胞膜破裂等導致植物體內一些酶功能喪失，表現出植物生長緩慢、代謝受阻，嚴重時可造成葉片萎蔫甚至死亡[34]。研究表明，鹽脅迫下促生菌(PGPR)通過分泌滲透保護物質提高植物抗鹽性，脯氨酸含量變化最大，它可通過增加胞內溶質濃度、調節滲透平衡減緩鹽對植物的毒害，并自身啟動酶促系統(SOD、POD、CAT)以清除過多活性氧來抵御外界環境，有效改善鹽脅迫下植物生長及生理代謝過程[35-37]。本研究中，菌株wp-8接種于鹽脅迫小麥后，小麥幼苗MDA含量顯著降低，脯氨酸含量及SOD、POD、CAT活性顯著提高，該結果與國內外報道的接種促生菌可提高作物抗鹽性、促進作物生長的結果一致[38-40]。但本研究僅說明在150 mmol·L-1NaCl濃度脅迫下接種wp-8可緩解小麥受氧化性損傷，在更高濃度鹽脅迫下菌株wp-8是否發揮其保護功能有待進一步研究。