鼠巨細胞病毒感染小鼠胎盤病理學的改變對小鼠子代宮內生長發育情況的影響

龔琦 陳素華 馬超

[摘要] 目的 觀察鼠巨細胞病毒（MCMV）感染小鼠胎盤病理學改變對子代宮內生長發育情況的影響。 方法 采用酶聯免疫吸附法，在性成熟期小鼠中選取未感染MCMV的雌鼠，進行合籠受孕。采用隨機數字表法將小鼠分為對照組與模型組，各8只。在孕齡12.5 d時，模型組透過胎盤進行MCMV懸液顯微注射，對照組注射等量培養基溶液;在孕齡18.5 d時，斷頸法處死雌鼠，觀察98只胎鼠各個器組織標本病理改變。 結果 模型組胎盤感染率和胎仔感染率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。有胎盤感染小鼠中胎仔感染率明顯高于無胎盤感染者，差異有統計學意義（P < 0.05）;在有胎盤感染小鼠中，有細胞滋養細胞增生、合體細胞結節增生及纖維素樣壞死者發生死胎和異常胎仔率明顯高于無細胞滋養細胞增生、合體細胞結節增生及纖維素樣壞死者，差異均有統計學意義（P < 0.05）;有纖維素樣壞死者畸胎率明顯高于無纖維素樣壞死者，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 經胎盤感染MCMV是導致宮內感染的重要途徑，MCMV感染是導致子代不良妊娠結局重要原因。

[關鍵詞] 巨細胞病毒;小鼠;胎盤感染;病理學;生長發育

[中圖分類號] R373.9 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0020-04

[Abstract] Objective To observe the efficacy of pathological placental changes after intrauterine murine cytomegalovirus （MCMV） infection on the intrauterine growth and development of fetal mice. Methods The mature mice without MCMV infection identified by enzyme-linked immunoabsorbent assay were served as the subjects. The male and the female mice were put into the same cage. According to the method of random number table， the mice were randomly divided into control group and model group， with 8 mice in each group. At day 12.5 of gestation， the placentas of the model group were injected with MCMV， while the control group was injected with cell maintenance medium. All female mice were executed at day 18.5 of gestation， and the change of tissues and organs of 98 fetal mice were observed. Results The placental infection rate and fetal infection rate in the model group were significantly higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the fetal infection rate increased significantly compared with those without placenta infection， the difference was statistically significant （P < 0.05）. In the placenta infection mice， the rates of stillbirths and abnormal fetuses in mice with cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis were significance higher than those without cytotrophoblast proliferative， syncytial trophoblast nodules and fibrinoid necrosis， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The teratogenic rate in mice with fibrinoid necrosis was significantly higher than those without fibrinoid necrosis， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The MCMV infection through placenta is an important approach for intrauterine infection. MCMV infection is an important cause of adverse pregnancy outcomes in offspring.

[Key words] Murine cytomegalovirus; Mice; Placental infection; Pathology; Growth and development

巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）具有潛伏期和再活化的生物學特性，可以導致終身感染[1]。人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）宮內感染對新生兒的出生結局產生嚴重影響[2]。孕婦感染HCMV會發生流產、早產、畸胎、死胎及神經系統發育落后等不良妊娠結局[3-5]。HCMV感染可改變胎盤組織結構[6]，從而影響胎盤功能及子代發育。

1 材料與方法

1.1 病毒

鼠巨細胞病毒（MCMV）Smith株購于中國典型培養物保藏中心（Chinese Center for Type Culture Collection，CCTCC），TCID50為104.55（即2.8×105）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 ?于湖北省疾控中心購買SPF級BALB/c雌鼠和雄鼠各20只，均為90 d齡，體重（22±2）g，飼養于同濟醫院實驗動物中心，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2016-0057，實驗動物合格證號：1394527。使用酶聯免疫吸附法篩選未感染MCMV小鼠，方法參考說明書。將雌雄小鼠1∶1合籠，觀察小鼠陰道，發現陰栓則為孕0 d。在孕12.5 d向對照組小鼠胎盤注射1 μL 3% FCS DMEM培養液;模型組小鼠胎盤注射1 μL MCMV上清，至少有1只胎鼠在孕鼠宮內保持5 d，即為建模成功[7]。

1.2.2 標本采集及處理 ?斷頸法處死孕18.5 d雌鼠，將活胎鼠、死胎鼠（包括吸收胎）依次取出。觀察胎鼠生長發育情況：取出活胎后，選取雌性胎鼠，用Sartorius BS系列精密電子天平稱重，使用分規分別測量胎鼠的身長和體長[8]。采集胎鼠主要臟器和胎盤組織標本，用緩沖液沖洗碾磨制備勻漿，采用聚合酶鏈式反應法檢測MCMV DNA[9]。胎盤MCMV DNA陽性判定為胎盤感染;胎仔任一臟器組織標本檢測結果為陽性則視為胎仔感染。

1.2.3 主要試劑及儀器 ?DMEM培養基購買于美國Hyclone公司（SH30022.01B），胎牛血清均購買于Gibco公司（10270-106）;DNA提取試劑購買于德國QIAGEN公司（LOT：163020026）;酶聯免疫吸附測定試劑盒從美國Trinity Biotech公司（IgM：904075;IgG：901389）購買，采用北京百晶生物技術有限公司BG-gdsAUTOTIO0型酶標儀（20620017020002）判斷結果;引物交由上海生工生物工程公司合成[7]。

1.2.4 胎盤病理學檢測 ?使用4%多聚甲醛固定標本，常規制作成石蠟切片（厚度4 μm）后顯微鏡檢，觀察絨毛組織的病理學變化。通過日本OLYMPUS BX50顯微鏡及HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統進行圖像采集、編輯[10-11]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 12.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料用例數表示，組間比較采用χ2檢驗及Fisher直接概率法（雙側）檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎盤感染與胎仔感染情況

模型組胎盤感染率（64%，32只）明顯高于對照組（0%），差異有統計學意義（P < 0.05）。在所有98個標本中，模型組胎仔感染率（32%，16只）明顯高于對照組（0%），差異有統計學意義（P < 0.05）。有胎盤感染的胎仔感染率（43.75%，14只）明顯高于無感染者（3.00%，2只），差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 胎盤病理學改變對子代生長發育的影響

模型組胎盤鏡下可見典型病毒包涵體，感染的胎盤內可見細胞滋養細胞增生、合體滋養細胞結節增生以及纖維素樣壞死，見圖1（封三）。在胎盤感染的小鼠中，有細胞滋養細胞增生、合體細胞結節增生及纖維素樣壞死者發生死胎和異常胎仔率明顯高于無細胞滋養細胞增生、合體細胞結節增生及纖維素樣壞死者，差異均有統計學意義（P < 0.05）;胎盤是否存在細胞滋養細胞增生或合體細胞結節增生與其胎仔畸胎發生率差異無統計學意義（P > 0.05）;有纖維素樣壞死者畸胎率明顯高于無纖維素樣壞死者，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1～3。

3 討論

3.1 研究意義

關于妊娠期HCMV感染引起宮內傳播機制尚不清楚。因此，有必要了解HCMV宮內傳播機制，為疾病預防和治療奠定基礎。

HCMV經血透過胎盤感染是宮內感染的重要途徑。HCMV感染后破壞胎盤淋巴管形成以及血管重構，阻礙人滋養層細胞祖細胞的發育，使絨毛生長停滯的在早期階段，阻止其分化和融合為合胞滋養層細胞[11-12]。正常妊娠生理中胎盤絨毛直徑減小從而擴大母胎間血氧交換表面積。絨毛內血管發生充血改變，細胞滋養細胞數量減少甚至消失。此時，妊娠晚期絨毛的主要結構和功能細胞就被合體滋養細胞所替代，并積聚形成多細胞結節。在部分細胞結節內可以觀察到細胞核裂解消失，細胞漿厚度變薄，圍繞絨毛血管周圍，形成血管合體細胞膜，這種結構可以更好地促進母體與胎兒之間的氣體交換。妊娠期內，蛻膜中血管也呈現適應性改變，更好地順應胎兒生長發育，同時有利于孕產婦持續妊娠以及分娩[13]。當機體出現環境改變時，胎盤會發生一系列病理性改變，殘存的絨毛出現間質水腫、淤血。胎盤蛻膜血管呈現出病理性改變，螺旋動脈血管管壁纖維化，管腔狹窄，導致母胎間物質交換受阻，影響胎兒發育[14-15]。

3.2 MCMV胎盤感染對子代感染的影響

本實驗發現，小鼠感染MCMV的病理與人感染CMV相似。模型組胎盤鏡下可見典型病毒包涵體，有胎盤感染子代MCMV的感染率明顯提高，無胎盤感染時2只小鼠出現子代感染陽性，可能提示既往感染，現在病毒檢測已轉陰。上述結論證實了經胎盤感染是導致宮內感染的重要途徑。HCMV感染后可產生毒血癥，病毒可直接損傷接觸細胞引起宮內感染，造成宿主的多器官損傷[16]。HCMV病毒可以侵入胎盤滋養層，通過絨毛基質進入胎兒體內，引起宮內感染，使胎兒組織器官分化推遲或中斷，出現生長發育異常情況[17]。

3.3 MCMV胎盤感染導致胎盤病理學改變對子代生長發育的影響

感染的胎盤內可見細胞滋養細胞增生、合體滋養細胞結節增生以及纖維素樣壞死等病理改變，可對子代生長發育造成一定影響。合體細胞發生損傷引起細胞滋養細胞增生，是胎盤絨毛自身修復的表現;合體細胞結節增多通常是由胎盤絨毛缺血缺氧導致;而機體免疫復合物反應導致纖維素樣壞死[18]。CMV感染胎盤后，介導機體發生免疫反應，導致部分絨毛發生病理改變，同時改變蛻膜細胞因子和趨化因子環境[19]，加重胎盤病理改變。CMV在胎盤中復制可導致細胞增殖和遷移失調[12]。Hamilton等[20]研究表明，單核細胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-α表達上調亦可對胎盤和胎兒造成損傷。

綜上，本實驗進一步驗證了經血透過胎盤感染是MCMV感染的重要途徑，MCMV感染可能是引起新生兒不良妊娠結局的重要原因。

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（收稿日期：2019-10-16 ?本文編輯：任 ?念）