功能性腹瀉脾虛證模型大鼠腸組織鈉離子通道蛋白的變化

李家立 王亮 白艷香

[摘要] 目的 觀察功能性腹瀉脾虛證模型大鼠腸組織NHE3、Na+-K+-ATPase、ENaC等離子通道蛋白的表達變化。 方法 采用隨機數字表法將24只3周齡雄性Wistar大鼠分為正常組和模型組，利用小平臺站立法聯合高乳糖飼料喂養建立功能性腹瀉脾虛證模型，造模14 d后取材，采用Western blot檢測腸組織中的各指標蛋白表達變化。 結果 造模后1 d，兩組大鼠體重均顯著重于造模前1 d（P < 0.01），但模型組顯著輕于正常組（P < 0.01）。模型組大鼠腹瀉率為100%。造模后，模型組大鼠結腸NHE3、Na+-K+-ATPase相對表達量均低于正常組（P < 0.05或P < 0.01），NHERF2、PKAR2相對表達量均高于正常組（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 Na+-K+-ATPase、NHE3等Na+通道蛋白的表達下調可能是功能性腹瀉脾虛證發生的分子生物學基礎，值得進一步研究證實。

[關鍵詞] 腹瀉;脾虛;Na+通道;NHE3;Na+-K+-ATPase

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）06（a）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the changes of NHE3， Na+-K+-ATPase and ENaC in intestine of functional diarrhea model rats with spleen deficiency. Methods Twenty-four male Wistar rats （3 weeks old） were divided into normal group and model group according to the random number table method. The model rats of functional diarrhea with spleen deficiency syndrome were made using the modified multiple platform method and high lactose feed. After the model was made， the materials were taken and the expression of various indexes in intestinal tissue was detected by Western blot. Results The first day after molding， the weight of rats in both groups was significantly heavier than that in the first day before modeling （P < 0.01）， but the weight of rats in model group was significantly lighter than that in normal group （P < 0.01）. The diarrhea rate of rats in model group was 100%. After molding， the relative expression of NHE3 and Na+-K+-ATPase in colon of model group was lower than that of normal group （P < 0.05 or P < 0.01）， the relative expression of NHERF2 and PKAR2 in colon of model group was higher than that of normal group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion The down-regulation of Na+-K+-ATPase， NHE3 and other sodium channel proteins may be the molecular biological basis of spleen deficiency syndrome of functional diarrhea， which is worth further study and confirmation.?

[Key words] Diarrhea; Spleen deficiency; Sodium channel; NHE3; Na+-K+-ATPase

功能性腹瀉是極其常見的消化系統疾病，近年來隨著人們飲食結構的改變、社會節奏的加快，功能性腹瀉脾虛證的發病率不斷升高。腹瀉是胃腸道對水和電解質分泌吸收的正常生理平衡被打破的結果，而Na+是維持組織液、血漿滲透壓、腸黏膜內外水電解質平衡的關鍵因素。腸道對電解質的吸收，主要是建立在對Na+的吸收基礎上，而對水溶性有機物質的吸收也基本上都是與Na+相偶聯。因此，Na+的吸收狀態直接影響腸道對于其他電解質、有機溶質的吸收情況;Na+吸收障礙會造成腸道滲透壓升高，進而導致腹瀉的發生。本實驗利用小平臺聯合高乳糖飼料喂養建立功能性腹瀉脾虛證模型[1]，觀察脾虛腹瀉模型大鼠腸組織中不同Na+通道蛋白表達變化。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 ?雄性Wistar大鼠（3周齡），24只，體重54.9～64.0 g，斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養于濟寧醫學院實驗動物中心，飼養環境：光照周期12 h/12 h，室溫22～25℃，相對濕度45%～60%，自由進食、飲水。倫理批號：2018-FY-012（濟寧醫學院醫學倫理委員會）。

1.1.2 實驗試劑 ?兔抗大鼠NHE3多克隆抗體（Abcam公司，ab95299）;兔抗大鼠NHERF1多克隆抗體（Abcam公司，ab3452）;兔抗大鼠NHERF2多克隆抗體（Invitrogen公司，PA5-50067）;兔抗大鼠PKAR2多克隆抗體（Abcam公司，ab38949）;兔抗大鼠Na+-K+-ATPase多克隆抗體（CST公司，3010S）;兔抗大鼠ENaC-γ多克隆抗體（Abcam公司，ab3468）;兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（Bioswamp公司，PAB36269）;山羊抗兔IgG（Bioswamp公司，SAB43714）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（Bioswamp，W1712）;蛋白質Marker（Thermo，26634）。

1.1.3 實驗儀器 ?電泳儀（BIO-RAD，mini protean 3 cell）;酶標儀（芬蘭雷勃，MK3）;干式恒溫器（杭州爽盛儀器，K30）;離心機（杭州奧盛，Icen-24R）;水浴鍋（Leica，HI1210）;全自動化學發光分析儀（上海天能，Tanon-5200）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 ?用高乳糖飼料喂養幼齡Wistar大鼠14 d;每日22：00至次日7：00將大鼠放置在特制方形箱體水槽中的小平臺上，箱體水槽大小為112 cm×62 cm×41 cm，箱內共設置15個圓形小平臺，每個小平臺臺面直徑8 cm，柱高10 cm;平臺周邊注水，水深1.5 cm，水溫維持在（22±2）℃;大鼠在平臺上可以自由活動，而一旦大鼠進入睡眠狀態則會因為肌肉舒張、松弛而落入水中，不得休息，以此建立脾虛腹瀉模型[1-3]。見圖1。

1.2.2 實驗分組 ?采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組，每組12只，共24只。正常組：同期正常飼養。模型組：高乳糖飼料喂養，每日22：00至次日7：00置入水環境小平臺站立，持續14 d。

1.2.3 實驗取材 ?造模14 d后，按每10毫升每千克體重大鼠給予4%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，低溫靜置2 h后，4℃ 3000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm，取上清。取血后即刻斷頭處死，冰上取腸組織，結腸至肛門向上2 cm開始，取結腸4 cm，用生理鹽水將腸內容物清洗干凈后，再分別放入福爾馬林固定液或液氮中，后轉入-80℃冰箱保存。

1.2.4 蛋白表達檢測 ?采用Western blot檢測各個觀察指標的表達變化，將組織剪成細小的碎片后，進行蛋白抽提，BCA法蛋白定量，將制備好的蛋白樣本經SDS-PAGE電泳分離后轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h（或4℃過夜），按各指標說明書（稀釋比例：NHE3、PKAR2、Na+-K+-ATPase、ENaC-γ、GAPDH為1∶1000;NHERF1、NHERF2為1∶2000）稀釋抗體后，加入一抗室溫孵育1 h（或4℃過夜），PBST洗脫后二抗室溫孵育1 h（或4℃過夜），PBST洗滌后ECL化學發光法顯色。最后將膜置于全自動化學發光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠造模前后體重比較

造模前1 d，兩組大鼠體重比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;造模后1 d，兩組大鼠體重均顯著重于造模前1 d（P < 0.01），但模型組顯著輕于正常組（P < 0.01）。見表1。

2.2 兩組大鼠造模前后糞便情況比較

造模前，兩組大鼠的糞便均為顆粒樣大便;造模后，同期飼養的正常組大鼠的糞便為顆粒樣大便，模型組大鼠的糞便為黃色稀便;造模操作使模型組大鼠出現明顯腹瀉情況，且腹瀉率為100%。見圖2。

2.3 兩組大鼠結腸組織各觀察指標蛋白相對表達量比較

造模后，模型組大鼠結腸NHE3、Na+-K+-ATPase相對表達量均低于正常組（P < 0.05或P < 0.01），NHERF2、PKAR2相對表達量均高于正常組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

3 討論

利用小平臺站立法聯合高乳糖飼料喂養制作的功能性腹瀉脾虛證模型大鼠，其體重增長趨勢緩慢，毛色枯槁，精神倦怠，便溏泄瀉，腸吸收功能減退[4-6]。其中腹瀉是該模型的典型癥狀，本研究采用此模型大鼠探討脾虛泄瀉腸組織中Na+通道蛋白的變化。

Na+是維持組織液、血漿滲透壓的重要組成部分，Na+的吸收狀態直接影響腸道對于其他電解質、有機溶質的吸收情況;Na+吸收障礙會造成腸道滲透壓升高，導致腹瀉的發生。腸細胞對Na+的吸收主要有三種方式[7]：①以ENaC為結構基礎的Na+生電性非偶聯吸收;②以NHE為結構基礎的電中性的NaCl吸收[8];③Na+與有機溶質的偶聯吸收，主要是以SGLT為結構基礎的Na+與葡萄糖的偶聯吸收[9]。本研究主要觀察前兩種方式。Na+的非偶聯吸收，是通過細胞腔面膜的ENaC，順化學梯度進入細胞內，再由基底膜鈉鉀泵（Na+-K+-ATPase）泵出細胞外。Na+-K+-ATPase對Na+的主動運輸，使細胞內Na+濃度維持在較低水平，為Na+及其他電解質等進出細胞提供電化學梯度，對于維持水鈉平衡、血容量及血壓起重要作用。本研究中模型組大鼠結腸組織中的Na+-K+-ATPase較正常組大鼠表達下降，會導致結腸黏膜組織的能量代謝異常、Na+泵出細胞外障礙，使大量Na+滯留在細胞內，引起細胞腫脹，細胞正常的生理功能受到抑制，腸道對水的吸收能力也顯著下降，可能是脾虛泄瀉的微觀表現之一。另外Na+-K+-ATPase表達減少，細胞內外的電化學梯度變化可能會影響胃腸平滑肌細胞的動作電位以及細胞內Ca2+的濃度，也可能會導致胃腸道動力紊亂[10]。Na+-K+-ATPase已被諸多進行中醫脾虛證研究的學者關注，研究發現，在脾虛狀態下大鼠細胞能量代謝障礙[11]，Na+-K+-ATPase活性降低[12]，回腸結腸組織Na+-K+-ATPase活性下降[13]，認為Na+-K+-ATPase活性下降可能是脾虛證的病理機制之一。很多中藥[14-15]、方劑[16-17]也是通過作用于Na+-K+-ATPase發揮對脾胃的調節作用。

電中性的NaCl吸收，是Na+和Cl-的偶聯吸收過程，包括了Na+-H+交換與Cl--HCO-3交換兩種逆向轉運。Na+-H+交換依賴于腸道中的多種Na+/H+交換體，其中NHE3更多地參與腸上皮細胞對Na+的吸收[8]。有研究[18]發現，NHERF在小腸對Na+的吸收方面發揮重要作用，NHERF對NHE的調節直接或間接地導致了腹瀉的發生[19]。本研究結果顯示，小平臺站立聯合高乳糖喂養造模后，出現脾虛泄瀉的大鼠腸組織中NHERF2表達升高，PKAR2表達升高，NHE3表達下降。筆者推測，NHERF2通過PKAR2對NHE3產生抑制效應，NHE3表達下調，造成Na+吸收減少而產生腹瀉，可能是脾虛泄瀉發生的分子機制。

綜上所述，Na+吸收的正常與否在腹瀉的發生、發展過程中發揮十分重要的作用，Na+-K+-ATPase、NHE3等Na+通道蛋白的表達下調可能是功能性腹瀉脾虛證發生的分子生物學基礎，值得進一步研究證實。

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（收稿日期：2019-12-12 ?本文編輯：李亞聰）