利用“藍白斑篩選”高效融合微生物學和基因工程實驗*

孫 娟 趙逸歐 劉長付

（1 北京市第五十七中學 北京 100038 2 首都師范大學附屬回龍觀育新學校 北京 102208 3 北京市第五中學 北京 100007）

高中階段，選修生物學的學生在實驗上需要更多的學習和實踐，其中包括培養基的配制、無菌操作、微生物的培養和分離、微生物的計數、微生物的鑒定［1］等基礎實驗。在基因工程實驗學習中，還涉及限制酶切割DNA、DNA 的連接、大腸桿菌的轉化和篩選［2］等實驗操作。學生在學習中，很多實驗都是做完拋之腦后，甚至有些實驗仍處于紙上談兵階段。因此，在學習中保持知識的連貫性，并學以致用非常重要。文獻調查顯示，“藍白斑篩選實驗” 可有效地貫穿以上知識和實驗內容［3－4］，以一個完整的大實驗形成科技實踐活動。通過實踐，可促進學生掌握知識，提高能力，提升科學素養。

1 實驗原理

細菌細胞吸收外源DNA 并發生可遺傳的改變，稱為轉化。通過Ca2+處理的化學方法誘導大腸桿菌進入感受態，有利于外源DNA 進入細菌內［3］。

β－半乳糖苷酶可使顯色底物X－Gal 分解為藍色，使菌落呈現藍色；若有外源DNA 片段插入至載體中，則β－半乳糖苷酶基因失活，從而產生白色菌落［3－4］。

2 實驗材料和儀器

2.1 材料：受體菌JM109（需在－80℃保存，或在干冰中短時間保存），pMD19－T 載體試劑盒、ITPG溶液、X－Gal、NaCl、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、冰、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、移液器、離心管、培養皿等。

2.2 儀器：恒溫培養箱、恒溫搖床、離心機、攪拌器、冰箱等。

3 實驗步驟

1）將ITPG 和X－Gal 配制為溶液，除菌后冷凍保存，備用。

2）制備LB 液體培養基、LB 固體培養基、含氨芐青霉素（標記為Amp+）的LB 固體培養基，備用。

3）重組質粒的制備：實驗組按照下表配制反應體系，使Insert DNA 與pMD19－T 載體（質粒）連接；對照組將表1 中的Control Insert 替換為等量蒸餾水，其他條件相同。

表1 pMD19-T 中插入Insert DNA 的反應體系

4）將質粒轉化至大腸桿菌：將實驗組和對照組的產物分別轉入感受態大腸桿菌中。①取出2管受體菌置于冰上融化；②冰上操作，將步驟3的反應產物分別與受體菌輕打混勻，冰上放置30 min；③熱激法轉化：將離心管放置于42℃水浴，熱激90 s，轉化中勿搖動離心管；④將離心管轉移至冰浴，放置1～2 min；⑤每管加400 μL LB 液體培養基，在37℃搖床緩慢搖動培養45 min，使細菌復蘇。

5）制備含ITPG、X－Gal 的培養基（現用現制）：取適量ITPG、X－Gal 溶液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基表面，晾干。

6）涂板：取100 μL 步驟4 獲得的轉化細菌分別涂布于添加IPTG、X－Gal 的培養基表面，37℃恒溫培養箱倒置培養12 h。

7）觀察：實驗組和對照組經轉化后的大腸桿菌菌落呈現出不同的顏色，若顯色不明顯，可將平板置于4℃培養2～4 h 后再觀察，分別統計實驗組、對照組中的藍斑和白斑數目。

4 結果與討論

按照以上步驟完成藍白斑篩選實驗后，需進一步根據菌落的顏色和數目計算重組效率，實驗結果如圖1（本文附圖見封四）所示。在實驗組里，外源DNA 與T 載體連接成功的會破壞β－半乳糖苷酶基因的表達，理論上應都應呈現白斑，但實際結果是仍有少量藍斑存在，推測其原因可能是T載體發生自連。但是，重組效率為93%可表明，重組比較成功。對照組只加入了T 載體，理論上不會產生白斑，然而實際上仍有白斑出現，因此，推測T 載體發生自連時，其末端的部分脫氧核苷酸脫落，使連接后的閱讀區發生改變，從而改變mRNA 的序列，導致蛋白質結構變化，最終引起性狀差異。

5 小結

通過藍白斑篩選實驗，培養基的配制、滅菌、無菌操作、DNA 的連接、菌落的計數等不再是孤立的實驗步驟，而是服務于一個大的實驗目的“通過外源基因的導入，使大腸桿菌發生轉化，最終產生白色的菌落”。在“藍白斑篩選”科技實踐活動中，知識學習更加系統化、能力提升更加全面化，實驗結果的分析和討論還能提高學生的思辨能力，從而全方位提升學生的學科素養和綜合素養。