麥蚜及植物病毒脅迫下小麥體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的變化

張 弛，孟琳欽，蘇 丹，仝則乾，胡祖慶

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是中國主要糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響國家糧食生產(chǎn)安全。小麥生長過程中常受到病毒病和麥蚜的危害。大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)在中國主要有4種株系，即GAV、PAV、RMV和GPV，其中GAV株系是引起中國小麥黃矮病的主流株系，可造成小麥植株矮化、葉片倒V字黃化，小麥黃枯后，受害植株下部葉片仍呈綠色[1]，是目前中國北方麥區(qū)的主要病毒病。麥蚜，屬半翅目蚜科(Hemiptera:Aphididae)，以刺吸小麥汁液，影響光合作用，還可傳播小麥病毒病，間接影響小麥生產(chǎn)[2]。中國常見的麥蚜有麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)、禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi)和麥長管蚜(Sitobionavenae)，麥二叉蚜和麥長管蚜是大麥黃矮病毒BYDV-GAV株系的傳毒介體[3]。在田間，BYDV-GAV和3種蚜蟲往往同時(shí)發(fā)生，因此亟需研究BYDV-麥蚜-小麥三者的互作關(guān)系，為指導(dǎo)小麥生產(chǎn)中蚜蟲和BYDV-GAV的綜合治理提供幫助。

植物的生長發(fā)育常受多種生物的侵?jǐn)_脅迫，植物病毒和介體昆蟲是其中影響較大的兩類。寄主植物受病毒侵染后，其正常生理代謝進(jìn)程被干擾，表現(xiàn)為植物生長受阻，產(chǎn)量和品質(zhì)降低，因此植物病毒病又被稱為“植物癌癥”[4]。植物病毒與寄主植物之間存在明顯的相互作用，植物病毒侵染植物后，可導(dǎo)致寄主植物的形態(tài)特征發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為葉片變異、組織壞死和畸形[5]；體內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)(volatile organnic compound，VOC)的種類與含量也會發(fā)生改變[6-7]；此外，寄主植物感染病毒后，體內(nèi)的氨基酸、碳水化合物等營養(yǎng)成分也會受到影響[8]。媒介昆蟲取食能影響寄主植物的生理狀態(tài)，如應(yīng)對刺吸式昆蟲取食，植物具有閉塞篩管的功能[9]，此外寄主植物還能提高防御信號物質(zhì)(如水楊酸、茉莉酸、活性氧等)的含量并激活相應(yīng)防御途徑以抵御昆蟲的脅迫[10-11]。與病毒脅迫相似，受媒介昆蟲危害后，寄主植物也會調(diào)節(jié)體內(nèi)防御性次級代謝產(chǎn)物的生成和釋放[12]。寄主植物在長期的進(jìn)化過程中，形成和構(gòu)建了應(yīng)對多種脅迫的防御系統(tǒng)和反應(yīng)機(jī)制，其中，活性氧在寄主植物應(yīng)對外源病毒侵染和植食性昆蟲取食過程中發(fā)揮了重要作用[13]。細(xì)胞外，活性氧具有直接殺死病菌的功能，而在細(xì)胞內(nèi)則通過發(fā)揮信號傳遞功能來啟動植物體內(nèi)防衛(wèi)基因的表達(dá)，活性氧過多時(shí)，植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會受到不可逆的損傷，最終死亡。植物體內(nèi)存在超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等活性氧清除酶系[14]，可避免過多的活性氧對植物造成損害；植物體內(nèi)還存在酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)等解毒酶以應(yīng)對病毒和媒介昆蟲的脅迫。ACP具有誘導(dǎo)活性，其活性受植物供磷狀況的影響，通過將環(huán)境中的有機(jī)磷降解為植物體可吸收的磷酸鹽和焦磷酸來供給植物營養(yǎng)[15]。目前，病毒和媒介昆蟲對植物的影響主要集中在植物受脅迫后體內(nèi)揮發(fā)物和營養(yǎng)成分的變化等方面，而對植物體內(nèi)保護(hù)酶系和解毒酶系活性的影響尚不明確。鑒于此，本研究以麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜為試蟲，以BYDV-GAV為測試病毒，分析蚜蟲、植物病毒及兩者共同脅迫下小麥體內(nèi)保護(hù)酶系和解毒酶系的活性變化規(guī)律，以期為探究蚜蟲-病毒-小麥三者間的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為蚜蟲和BYDV-GAV的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試小麥

供試小麥品種為矮抗58，來自陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。采用盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)用盆為PVC塑料盆，直徑9 cm，高8 cm。播種前用清水將小麥種子浸泡24 h，隨后將4～5粒種子撒入裝有2/3體積育苗基質(zhì)的PVC塑料盆中，最后再覆蓋1/3體積的育苗基質(zhì)。用噴壺噴水至浸透育苗基質(zhì)，播種后，用透明塑料籠罩(頂端帶有紗網(wǎng))罩住塑料盆，放入人工氣候箱(溫度25 ℃，相對濕度60%，光周期14L∶10D)培育，待小麥長至一心一葉期時(shí)備用。

1.1.2 供試毒源

在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場麥田(34°17'18.8"N，108°04'06.0"E)顯癥的小麥植株上采集麥二叉蚜，通過RT-PCR方法進(jìn)行BYDV株系鑒定，BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 3種株系的鑒定引物設(shè)計(jì)均參考劉雙清[16]的方法，確認(rèn)麥二叉蚜體內(nèi)僅含有GAV株系后，放入人工氣候箱內(nèi)單頭長期飼養(yǎng)。蚜蟲和植物每隔2～3代后，均進(jìn)行BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 株系的檢測，以確保存在僅感染大麥黃矮病毒GAV株系。

1.1.3 供試蟲源

采集地點(diǎn)同1.1.2。單頭采集麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜，每采集點(diǎn)相隔至少5 m，采集后在人工氣候箱內(nèi)單頭飼養(yǎng)10代以上形成單克隆系，進(jìn)行RT-PCR鑒定(鑒定方法同1.1.2)，確保其體內(nèi)不含BYDV任何株系后備用。

1.1.4 主要儀器和試劑

Infinite M200全波長酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；BIC-300人工氣候箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。POD過氧化物酶試劑盒、CAT過氧化氫酶試劑盒、SOD超氧化物歧化酶試劑盒、ACP酸性磷酸酶測試盒和AKP堿性磷酸酶測試盒，均生產(chǎn)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)麥蚜影響小麥酶活性試驗(yàn)。小麥長至一心一葉期后，每盆保留3株小麥，接入30頭(每株10頭)24 h內(nèi)初生的無毒麥二叉蚜/禾谷縊管蚜/麥長管蚜作為麥二叉蚜處理組(Sg1)/禾谷縊管蚜處理組(Ra1)/麥長管蚜處理組(Sa1)，不接種蚜蟲的健康小麥作為對照組(CK1)。待長至成蚜后，剔除所接蚜蟲，分別收集花盆中的3株小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，將采集的葉片進(jìn)行下一步的酶活測定。每個(gè)處理重復(fù)3次。

(2)BYDV影響小麥酶活性的試驗(yàn)。小麥長至一心一葉期后，每盆保留3株小麥，處理組(BYDV)每盆接入15頭(每株5頭)攜帶BYDV-GAV株系麥二叉蚜3齡若蚜，對照組(CK2)接入無毒麥二叉蚜3齡若蚜。處理72 h后，剔除所接蚜蟲，并分別收集花盆中的3株小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，通過RT-PCR鑒定確認(rèn)處理組3株小麥均含有BYDV-GAV病毒后，將采集的葉片進(jìn)行下一步的酶活測定。每個(gè)處理重復(fù)3次。

(3)蚜蟲與BYDV病毒共同影響小麥酶活性的試驗(yàn)。通過接種攜帶BYDV-GAV株系麥二叉蚜3齡若蚜的方法獲得帶毒小麥，每盆保留3株小麥，每盆接入30頭(每株10頭)24 h內(nèi)初生的無毒麥二叉蚜/禾谷縊管蚜/麥長管蚜若蚜作為麥二叉蚜處理組(Sg2)/禾谷縊管蚜處理組(Rp2)/麥長管蚜處理組(Sa2)，選擇感染植物病毒但未受蚜蟲脅迫的小麥作為空白對照組(CK3)，待30頭若蚜均長至成蚜后剔除，分別收集小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，通過RT-PCR鑒定，確認(rèn)處理組3株小麥均含有BYDV-GAV病毒后，將采集的葉片進(jìn)行下一步的酶活測定。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 酶活測定方法

取經(jīng)過處理的新鮮葉片0.2 g與無菌0.9%生理鹽水(測SOD活性需加等量的PBS緩沖液)按質(zhì)量∶體積=1∶9的比例混合并加入少量石英砂，在冰上迅速將葉片研磨成勻漿液，轉(zhuǎn)入離心管4 ℃ 2 500 r·min-1離心10 min，上清液即為酶原液。所有酶活性均按照南京建成酶活試劑盒的方法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel軟件分析整理數(shù)據(jù)，計(jì)算酶活性；用SPSS 20.0 軟件對酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Tukey法(P=0.05)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種麥蚜對小麥體內(nèi)主要保護(hù)酶和解毒酶活性的影響

由表1可知，與不接種蚜蟲的健康小麥(CK1)相比，麥二叉蚜處理組(Sg1)小麥體內(nèi)的POD活性無顯著差異，禾谷縊管蚜處理組(Rp1)小麥體內(nèi)的POD活性顯著下降，降幅為 34.59%，麥長管蚜處理組(Sa1)則顯著上升，增幅為83.88%；Sg1和Rp1小麥體內(nèi)CAT、SOD和AKP活性均與CK1無顯著差異，而Sa1小麥體內(nèi)CAT、SOD和AKP活性則均顯著上升，增幅分別為91.21%、126.45%和468.82%；Sg1和Sa1小麥體內(nèi)ACP活性均顯著高于CK1，增幅分別為100.46%和197.26%，而Rp1則無顯著差異。

表1 不同麥蚜處理組健康小麥體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性

2.2 BYDV對小麥體內(nèi)主要保護(hù)酶和解毒酶活性的影響

由表2可知，與未感染植物病毒的小麥(CK2)相比，感染BYDV-GAV病毒(BYDV)的小麥體內(nèi)，POD、CAT、ACP和AKP活性均無顯著差異，SOD酶活性則顯著上升，增幅達(dá) 37.41%。說明BYDV病毒對小麥體內(nèi)POD、CAT、ACP和AKP活性無明顯影響，但能導(dǎo)致小麥體內(nèi)SOD活性顯著增加。

表2 感染與未感染病毒處理組小麥體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性

2.3 麥蚜對感染BYDV-GAV小麥體內(nèi)主要保護(hù)酶和解毒酶活性的影響

由表3可知，與感染植物病毒但未受蚜蟲脅迫的小麥(CK3)相比，麥二叉蚜處理組(Sg2)、麥長管蚜處理組(Sa2)和禾谷縊管蚜處理組(Rp2)小麥體內(nèi)的CAT活性均顯著上升，增幅分別達(dá)110.72%、115.13%和70.19%；Sg2、Rp2和Sa2的SOD活性均與CK3無顯著差異；Sg2和Sa2小麥體內(nèi)POD活性顯著高于CK3，增幅分別達(dá)73.66%和97.58%，Rp2與CK3則無顯著差異；Sg2和Rp2小麥體內(nèi)ACP活性顯著高于CK3，增幅分別為50.49%和37.00%，Sa2與CK3則無顯著差異；Sa2小麥體內(nèi)AKP活性顯著高于CK3，增幅達(dá)3 665.03%，Sg2和Rp2與CK3則無顯著差異。

表3 不同麥蚜處理下感染BYDV小麥體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性

3 討 論

植物為應(yīng)對植食性昆蟲的脅迫，體內(nèi)會產(chǎn)生活性氧(ROS)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)，而SOD、CAT和POD組成的保護(hù)酶系可以清除過多的ROS，保護(hù)植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[17-19]，因而保護(hù)酶系的活性變化可作為觀察指標(biāo)，以確認(rèn)植物是否對外界脅迫產(chǎn)生了誘導(dǎo)防御反應(yīng)，從而判斷植物對某種昆蟲的抗性強(qiáng)弱以及昆蟲對寄主植物的適合度[20-21]。

吳龍火等[17]和茍長青等[21]分別研究了害蟲脅迫下植物山羊草和苜蓿體內(nèi)的保護(hù)酶系變化規(guī)律，均發(fā)現(xiàn)植物對不同種類害蟲的防御反應(yīng)具有差異性，本研究表明，小麥對麥長管蚜的防御反應(yīng)強(qiáng)度高于麥二叉蚜和禾谷縊管蚜，也得到了類似的結(jié)論。本研究也從側(cè)面印證了實(shí)際觀察中發(fā)現(xiàn)的麥長管蚜在小麥苗期時(shí)比禾谷縊管蚜和麥二叉蚜的適合度低這一現(xiàn)象，其具體機(jī)制則需進(jìn)一步研究確定。與未感染病毒的植物相比，BYDV-GAV脅迫下，小麥體內(nèi)SOD活性顯著升高，可能是因?yàn)椴《厩秩臼剐←滙w內(nèi)超氧自由基含量上升，過量的超氧自由基則刺激SOD酶活性提高以抑制細(xì)胞膜質(zhì)過氧化作用，這與玉米對矮花葉病毒[14]及棉花對紅腐病菌[22]的防御反應(yīng)表現(xiàn)一致。

在田間，植物病毒與害蟲往往同時(shí)發(fā)生，兩者的互作關(guān)系會對小麥體內(nèi)的生化防御產(chǎn)生影響，到目前為止此類研究還未見有報(bào)道。本研究分析了BYDV-GAV存在條件下麥蚜對小麥體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響，結(jié)果表明，與感染BYDV-GAV但未受蚜蟲脅迫的小麥相比，麥二叉蚜與麥長管蚜脅迫下小麥體內(nèi)的POD、CAT活性均顯著升高，禾谷縊管蚜脅迫下僅有CAT活性顯著上升，推測這可能是因?yàn)樵诓《敬嬖跅l件下，麥蚜的取食危害使得小麥體內(nèi)的H2O2含量急劇升高，小麥需要提高POD和CAT活性或者合成更多的酶來降解，而H2O2升高的原因與SOD催化超氧自由基產(chǎn)生H2O2與O2是否有關(guān)則需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

磷酸酶是一種能將有機(jī)磷分解為植物體直接吸收的無機(jī)磷的水解酶，ACP與AKP的區(qū)別在于：ACP需在酸性條件下參與催化反應(yīng)，而AKP則具有非特異性[23-24]，植物體內(nèi)二者活性受到植物供磷狀況的影響，可作為植物面對磷脅迫的變化指標(biāo)，以判斷植物對磷的利用情況[25-26]。本研究表明，麥長管蚜和麥二叉蚜取食使小麥出現(xiàn)低磷脅迫，需提高磷酸酶的活性以應(yīng)對低磷脅迫，而禾谷縊管蚜取食、BYDV-GAV侵染不會對小麥造成磷脅迫。但在BYDV-GAV存在條件下，麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜均能使小麥出現(xiàn)低磷脅迫，這可能是因?yàn)楹坦瓤O管蚜與BYDV-GAV聯(lián)合脅迫對小麥產(chǎn)生了不良影響，使其出現(xiàn)低磷脅迫。

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)長期進(jìn)化過程中，大麥黃矮病毒(BYDV)-介體麥蚜-小麥三者間形成了復(fù)雜的互作關(guān)系。本研究僅在室內(nèi)控制條件下分析了BYDV和麥蚜脅迫下小麥體內(nèi)的保護(hù)酶和解毒酶活性，其變化規(guī)律還有待在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，有必要在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究小麥體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的基因表達(dá)量，為明確小麥抗性生化機(jī)理和防御反應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，從而了解小麥應(yīng)對不良環(huán)境脅迫時(shí)的基因適應(yīng)機(jī)制。