云南鐵殼麥的穗發芽抗性鑒定與分析

周國雁，陳 丹，隆文杰，武曉陽，蔡 青，伍少云

(云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南昆明 650205)

小麥穗發芽(pre-harvest sprout,PHS)是指小麥在成熟收獲前遭遇連續陰雨或潮濕環境，其籽粒在穗上發芽[1-2]的自然災害現象。這種現象使小麥嚴重減產、加工品質下降、種用價值盡失[3]，是全世界小麥生產與育種研究都需要重視和解決的問題。影響小麥穗發芽抗性的因素很多，如種子休眠特性[4-6]，種皮滲透性和顏色，α-淀粉酶活性和內源激素水平[7]，穗的形態與結構學特征及功能，包殼的機械隔水或持水功能及其可能存在的發芽誘發或抑制物質[8]等。

鑒定小麥穗發芽抗性的方法有田間延期收獲法、穗發芽試驗、種子發芽試驗、酶活性測定及分子標記輔助選擇等。其中，整穗發芽法能從穗部形狀、種子休眠、刺激誘發或抑制物質等方面直觀、準確地反映不同品種的穗抗發芽性[9]。種子發芽法雖然操作簡便易行，但其結果只是反映了籽粒的休眠特性，不能真實代表穗發芽抗性[10]。隨著分子生物學的不斷發展和進步，分子標記技術也被用于小麥的穗發芽抗性鑒定。楊 燕等[11]根據玉米控制籽粒休眠相關的轉錄子 Vp1開發了用于鑒定小麥種子休眠性的STS功能標記Vp1B3，并被利用和驗證[12-14]。ZHANG等[15]研發并驗證了CAPS功能標記sdr-5，發現Tasdr-B1基因既與穗發芽抗性相關又與種子休眠性相關。王根平等[16]利用Tamyb10基因的分子標記,檢測了119 份來自不同麥區的紅粒小麥材料,發現Tamyb10D1基因對穗發芽抗性的影響最大，與紅粒品種的高穗發芽抗性相關。王 瑜等[17]利用與穗發芽抗性相關的STS標記Tamyb10D和Vp1B3及CAPS 標記TaDFR-B對2 套(78和103 份)白粒小麥材料的穗發芽抗性進行綜合篩選，發現標記Tamyb10D能有效地鑒別白粒小麥品種的穗發芽抗性。STS標記Vp1A3與Vp1B3一樣，也是根據白粒小麥休眠基因viviparous-1在穗發芽抗性不同的小麥材料中的序列差異而設計的與白粒小麥穗發芽抗性相關的分子標記，表現出了高效的篩選效果[11-12,18]。

云南鐵殼麥是云南小麥(T.aestivumssp.yunnanense，AABBDD)的俗稱，隸屬于普通小麥種下的中國西南地區的稀有亞種。曾經只分布在云南省怒江、瀾滄江兩岸的部分縣、區[19]。常被種植于海拔1 500～2 500 m、年均溫度15 ℃和年降雨量1 480 mm左右的山區、半山區的林間空地、箐溝邊、坡耕山地之中，對當地的特殊農業生態系統有著獨特的適應性，是小麥新品種選育的重要基因資源，也是探討栽培六倍體小麥起源與演化的橋梁種質資源。其成熟期正是當地的雨季，具有強穗發芽抗性[19]。有關云南鐵殼麥的穗發芽抗性或種子休眠性的研究很少有報道。楊金華等[20]鑒定了32份云南鐵殼麥的穗發芽抗性和種子休眠性，認為其穗發芽抗性主要來源于種子的強休眠性、穎殼的機械作用和浸出物的抑制作用。本研究擬以推廣良種云麥53號為對照，利用整穗和整粒發芽法、分子功能標記法綜合鑒定、評價55份云南鐵殼麥的穗發芽抗性及種子的休眠特性，分析不同抗性級別、不同休眠級別、不同基因型材料在種子發芽指數、發芽率方面的差異，探討其穗發芽抗性、種子休眠性的機制，為進一步保護和利用這種珍稀小麥種質資源、篩選高抗穗發芽的材料提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料共56份，其中55份為云南鐵殼麥，另1份為對照品種云麥53號(表2)，由云南省作物種質庫保存和提供。全部材料于2018年10月下旬種植在云南省農業科學院位于昆明市嵩明縣小街鎮的試驗基地(25°21′23″N，103°06′39″E)。2019年5月中旬蠟熟時收獲。田間常規管理，生長期間不曾遭遇雨、雪、霜凍等自然災害。但在苗期遭遇暖冬，4至5月抽穗、開花和灌漿及成熟期遭遇高溫、干旱影響。嵩明縣2019年4月17日至5月20的日最高氣溫達31 ℃，4、5月的月均最高溫為26 ℃和27 ℃，較2018年同期溫度升高 3 ℃和4 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 整穗發芽率(SGR)的測定

整穗發芽率測定參照劉光輝等[14]的方法并作適當修改。隨機選取成熟度基本一致的6個單株的主穗，于蠟熟期收獲，10 d后，分別帶莖扎成束，稱重；浸泡在盛有自來水的塑料箱中，為阻止麥穗上浮，用另一較小的塑料箱裝水壓頂；6 h后撈出麥穗，用吸水紙吸干麥穗表面水分，復稱重，計算麥穗的持水率(HWR)，用此評價參試材料麥殼的隔水作用。HWR=(麥穗吸水后重量-吸水前重量)/吸水前重量×100%。將復稱重后的麥穗垂直插于裝有沙土的塑料箱中，置于溫度25 ℃和相對濕度 85%的人工氣候箱(DRXM-508C-4，寧波江南儀器廠)內暗發芽。每天向穗頂部噴淋水以保持濕度。7 d后，取出麥穗并立即于65 ℃烘箱中烘干24 h，阻止其進一步發芽。手工剝出籽粒，以見芽或根者為發芽，記錄發芽的種子數，計算整穗發芽率(SGR)。SGR=6穗的發芽粒數/6穗的總粒數×100%。

1.2.2 發芽指數(GI)和發芽率(GP)的測定

選取同期收獲的麥穗，手工剝出籽粒，將其腹溝朝下置于墊有濾紙的培養皿內，加適量無離子水，與1.2.1相同條件下發芽。每份材料重復3次，每次50粒。從試驗2 d開始，以芽長達到種子長度一半為發芽，統計發芽的籽粒數，直到發芽試驗結束止。計算發芽指數(GI)=(n1×7+n2×6…n7×1)/(7×50)×100%，發芽率(GP)=7天發芽的種子數/50×100%。式中n1、n2、…、n7是第1、第2、…、至第7天發芽的籽粒數,50表示用于發芽的種子總數。

1.2.3 穗發芽抗性及種子休眠性的分級

穗發芽抗性分級：以穗發芽率為分級指標時，參照NY/T 1739-2009的小麥抗穗發芽性檢測方法，以相對發芽率I(供試材料的穗發芽率/對照品種的穗發芽率)將參試材料的穗發芽抗性分為5級，即高抗(I≤0.05)、抗(0.050.60)；以發芽指數為分級指標時，參照張維軍等[21]的5級分級方法，即高抗(GI<5%)、抗(5%≤GI<20%)、中抗(20%≤GI<40%)、中感(40%≤GI<60%)和高感(GI≥60%)。

種子休眠性分級：以籽粒發芽率為依據，參照白宇浩等[13]劃分小麥穗發芽抗性的4級標準并作適當調整，將參試材料的種子休眠性劃分為5級，即深休眠(GP≤10%)、休眠(10%

1.2.4 試驗材料DNA的提取及其PCR擴增

取1.2.2中生長7 d的新鮮嫩苗，采用改進的 CTAB 法提取其基因組DNA[22]。

5個功能標記Vp1B3、Tasdr-B1、Tamyb10D1、Tamyb10D和Vp1A3(表2)的PCR 擴增體系為20 μL，包括2× Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，模板 1.5 μL(25 ng·μL-1)，ddH2O 7.7 μL。所用試劑均購于擎科生物技術有限公司。PCR擴增程序為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，53～66 ℃退火45～50 s，72 ℃1 min，35個循環；72 ℃3 min。其中，Vp1B3和Tasdr-B1退火 45 s，Tamyb10D1、Tamyb10D和Vp1A3退火50 s。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 數據統計分析

利用SPSS Statistics 19進行方差分析及t測驗。

2 結果與分析

2.1 供試材料的穗發芽抗性及分級

以整穗發芽率(SGR)為評價指標，除鳳慶硬殼麥(云0624/XM0909)的SGR為2.0%外，其余54份參試云南鐵殼麥的SGR都為0，對照云麥53號的 SGR為76.2%(表2和圖1)，云南鐵殼麥的SGR明顯低于對照品種。按NY/T 1739-2009的5級分級標準，參試云南鐵殼麥的穗發芽抗性均為高抗。

表1 試驗選用的5個標記

圖1 對照云麥53(左)和云南鐵殼麥(右)的穗發芽對比

55份云南鐵殼麥的GI值在15.5%～72.8%之間，平均為40.8%，較對照品種云麥53號(65.7%)低約25.0%(表2)。按張維軍等[21]的5級分級法，檢測到抗穗發芽材料(臨滄鐵殼麥-云0006/XM0927等)5份、中抗材料(騰沖鐵殼麥-云0001/ZM08780等)23份、中感材料(龍陵長芒大河頭小麥-云0004/XM0911等)22份、高感材料(雙江鐵殼麥(8)-云0013/XM0903等)5份，分別占參試鐵殼麥材料數的9.1%、41.8%、40.0%和9.1%。對照云麥53號表現為高感穗發芽。抗、中抗、中感、高感材料的GI分別為15.5%～ 18.7%、20.4%～39.4%、40%～59.6%和 60.3%～72.8%，平均值分別為17.7%、31.6%、50.3%和66.4%。4個級別材料的GI差異極顯著(P<0.01)。

2.2 參試材料種子的休眠性及分級

從表2可知，55份云南鐵殼麥的籽粒發芽率(GP)在23.2%～94.0%之間，均值為57.3%，明顯低于對照云麥53號(92.0%)。參試云南鐵殼麥中無深休眠的材料，休眠材料有耿馬鐵殼麥(云0614/XM0933)、云縣硬殼麥(云0622/XM0897)和鳳慶硬殼麥(云0623/XM0908)共3份；中度休眠的有騰沖鐵殼麥(云0001/ZM08780)、臨滄鐵殼麥(云0006/XM0927)、雙江鐵殼麥(1)(云0008/XM0900)等29份；淺休眠有龍陵長芒大河頭小麥(云0004/XM0911)、雙江鐵殼麥(2)(云0007/XM0899)、龍陵項芒大河頭小麥(云0005/XM0912)等18份；無休眠的有雙江鐵殼麥(8)(云0013/XM0903)、永德項芒鐵殼麥-1(云0040/XM0916)和永德項芒鐵殼麥(3)(云0042/XM0917)等5份材料，各自的GP為 23.3%～27.3%、32.0%～57.3%、60.7%～77.0%和 80.7%～94.0%，均值分別為25.3%、47.8%、70.1%和87.2%。四個休眠級別參試材料的平均發芽率間存在極顯著差異(P<0.01)。

表2 參試材料的發芽率與穗發芽抗性

2.3 云南鐵殼麥抗穗發芽機制分析

由表2可知，對照云麥53號的整穗和籽粒發芽率為76.2%和92.0%，麥穗持水率為33.1%。云南鐵殼麥的整穗發芽率為0.0～2.0%，籽粒發芽率為23.2%～94.0%，麥穗持水率在23.6%～50.2%之間，平均為32.6%，與對照的麥穗持水率接近。其中，麥穗持水率在30.0%以下的材料21份，占參試鐵殼麥的38.2%，在30.0%以上的材料34份，占參試鐵殼麥的61.8%。說明大多數云南鐵殼麥的穎殼并未阻止其籽粒或種子對水分的吸收，造成整穗與籽粒發芽率巨大差異的原因可能是其穎殼中存在發芽抑制物。推測云南鐵殼麥的高抗穗發芽能力可能主要與其穎殼內的發芽抑制物質有關。

2.4 云南鐵殼麥穗發芽抗性或種子休眠性的分子特征

為探討云南鐵殼麥抗穗發芽特性的分子基礎，選用被廣泛應用的Vp1B3等5個STS標記對參試材料進行檢測。

標記Vp1B3可在53份云南鐵殼麥和對照材料中擴增出A(約652 bp)、B(約569 bp)及C(無帶)3種帶型(圖2和表3)。其中，擴增出A帶型的材料49份，占90.7%；擴增出B帶型的材料僅1份，為對照云麥53號；無擴增產物的材料4份，占7.4%。A帶型材料的GI均值(41.1%)與B帶型材料的GI之間存在極顯著差異(P< 0.01)；C帶型材料的GI均值(38.7%)與B帶型材料的GI則存在顯著差異(P<0.05)；但A帶型與C帶型材料的GI間無顯著差異。A帶型材料的GP值(57.5%)與B帶型材料的GP值有極顯著差異(P<0.01)；C帶型材料的GP值(53.7%)與B帶型材料的GP值間差異顯著(P<0.05)；A帶型材料與C帶型材料的GP值間無顯著差異。

M：DL2000；1：云0613/XM0905雙江鐵殼麥；2：云0613(1)雙江鐵殼麥；3：云0613(2)雙江鐵殼麥；4：云0614/XM0933耿馬鐵殼麥；5：云0615/XM0934耿馬鐵殼麥；6：云0616/XM0932 瀾滄鐵殼麥；7：云0617/XM0914永德紅硬殼麥；8：云0618/XM0921云縣鐵殼麥；9：云0619/XM0922永德光頭鐵殼麥；10：云0620/XM0923永德硬殼麥；11：云0621/XM0896云縣鐵殼麥；12：云0622/XM0897云縣鐵殼麥；13：云0623/XM0908風慶鐵殼麥；14：云0624/XM0909風慶鐵殼麥；15：云0370-1黑殼鐵殼麥；16：云0612/XM0904雙江鐵殼麥；17：CK云麥53。

表3 標記 Vp1B3擴增的3種帶型及其發芽指數和籽粒發芽率的差異

用標記Vp1A3在51份云南鐵殼麥和對照材料中擴增出A(170 bp)、B(約762 bp，目標片段)、C(無帶)及D共4種帶型(圖3)，D帶型只有1份材料，不列入統計。擴增出A帶型的材料15份，占28.8%；擴增出B帶型的材料3份(含對照品種)，占6.0%；擴增出C帶型的材料34份，占 65.4%。A帶型材料的GI均值(39.1%)與B帶型(25.7%)、C帶型材料(44.0%)的GI均值之間無顯著差異；但B帶型與C帶型材料的GI均值存在顯著差異(P<0.05)。

M：DL2000；1：云0001/ZM08780騰沖鐵殼麥；2：云0003/ZM0910龍陵大河頭小麥；3：云0004/ZM0911龍陵長芒大河頭小麥；4：云0006/ZM0927臨滄鐵殼麥；5：云0007/ZM0899雙江鐵殼麥(2)；6：云0008/ZM0900雙江鐵殼麥(1)；7：云0005/ZM0912龍陵頂芒大河頭小麥；8：云0009/ZM08806雙江鐵殼麥<4>；9：云0010/ZM0901雙江鐵殼麥<3>；10：云0011/ZM08837雙江鐵殼麥-4；11：云0012/ZM0902雙江鐵殼麥(6)；12：云0013/ZM0903雙江鐵殼麥(8)；13：云0015雙江無芒鐵殼麥；14：云0016雙江長芒鐵殼麥；15：云0017/ZM0898雙江長芒鐵殼麥；16：云0020/ZM0907風慶鐵殼麥；17：CK云麥53。下同。

用標記Tamyb10D1(圖4)在53份云南鐵殼麥和對照材料中可擴增出1 353 bp的目標條帶(A)和無帶(B)2種帶型。其中A帶型的材料32份(含對照品種)，占59.3%；B帶型的22份材料，占40.7%。但2種帶型材料的 GI、GP均無顯著差異(P<0.05)。

圖4 標記 Tamyb10D1擴增的2種PCR片斷類型

用標記Tasdr-B1能擴增出650 bp(目標片段)和無帶2種帶型，2種帶型材料的GI和GP間均無顯著差異(P<0.05)。用標記Tamyb10D則沒擴增到目標片段(1 629 bp)。

3 討 論

由于種子的休眠特性與穗發芽抗性緊密相關，并能解釋一半以上的穗發芽抗性變化[2]；種子休眠性的強弱可以通過檢測種子的發芽指數或發芽率判斷，與測定穗發芽率相比，測定種子的發芽指數或發芽率更簡便易行，所以大多數研究者都以種子休眠特性代替穗發芽抗性[13,21,24]。但種子發芽率不能真正代表穗發芽抗性。本試驗證明了通過種子休眠性鑒定穗發芽抗性的局限性。參試的55份云南鐵殼麥的穗發芽率很低，100.0%的材料都表現為高抗穗發芽。但同期收獲種子的發芽指數在20.0%及以上，表現為中抗穗發芽至高感穗發芽的材料50份，占參試鐵殼麥的90.9%；籽粒發芽率在30.0%以上，休眠性為中等至無休眠的材料52份，占參試鐵殼麥的94.5%。用籽粒發芽法獲得的穗芽發抗性與用整穗發芽法獲得的抗性一致的材料只有10.0%。因此慎用籽粒發芽法來鑒定、篩選高抗穗發芽的材料。

云南鐵殼麥的種子有一定的休眠期和極強的休眠性，但其休眠性可能易受種植環境、特別是溫度的影響。本研究團隊2018年用整粒、半粒發芽法鑒定了來自與本研究試驗地塊相同、且包括本研究所用55份鐵殼麥材料在內的62份種子的休眠性。發現這批種子在收獲后30 d的整粒發芽率為0.0%～41.3%，平均16.4%；收獲82 d后的整粒發芽率為27.3%～96.7%，平均65.5%，整粒發芽率達80.0%及以上的材料僅18份，占29.0%，約70%的材料仍處于種子休眠期，表明所有材料的種子都有較長的休眠期和極強的休眠性。但本試驗中，收獲10 d后的籽粒發芽率已達23.3%以上，平均為57.3%，接近2018年收獲 82 d后的發芽水平，表明這批種子的休眠性較弱。分析種植地點2018-2019年小麥抽穗、揚花及灌漿成熟期間的氣溫，發現2019年的溫度較2018年同期升高了3 ℃～4 ℃。推測高溫可能會降低小麥種子的休眠性，因為在籽粒發育、成熟階段，母體植株所處的環境溫度更溫涼時，籽粒的休眠性更強[25-26]。

本研究認為，云南鐵殼麥高抗穗發芽的機制主要是穎殼內的浸出物或發芽抑制物單獨、或與種子休眠性共同作用的結果，與楊金華等[20]的研究結果基本一致。對究竟是什么物質以及如何抑制穗發芽的發生，還需要進一步深入研究。

楊 燕等[11]、孫曉燕等[12]、白宇皓等[13]和劉光輝等[14]都認為標記Vp1B3是一個與小麥穗發芽抗性相關、能夠用于穗發芽抗性輔助選擇的分子標記。因為具有Vp1B3基因型、特別是具有抗穗發芽Vp1B3(569 bp)和高抗穗發芽Vp1B3(845 bp)基因型的材料，其發芽指數均值顯著或極顯著低于具有感穗發芽(652 bp)基因型的材料。但是，能擴增出569 bp條帶的材料，其發芽指數也可能較高，如浚麥K8(61.8%)[13]。相反，能擴增出652 bp條帶的材料，其發芽指數也可能較低，如本研究中的關215(0.29%)、周麥24(3.71%)和HD2932(4.95%)等。該標記在對照云麥53號中也能擴增出569 bp的條帶，但云麥53號的發芽指數高達 65.7%，屬于高感穗發芽的品種。另外，53份鐵殼麥中，有49份擴增出562 bp條帶，但整穗發芽法顯示，這些材料都高抗穗發芽。因此，標記Vp1B3不適用于云南鐵殼麥穗發芽抗性或種子休眠性的鑒定，與孫果忠等[27]的結果一致。其他4個標記擴增到不同帶型材料的發芽指數、發芽率差異均不明顯。所以，本研究所用的5個標記均不能解釋云南鐵殼麥穗發芽抗性的變化。