普通小麥-濱麥及其衍生系的染色體組成分析

楊曉菲，王長(zhǎng)有，陳春環(huán)，田增榮，吉萬全

(1.渭南師范學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,陜西渭南 714099; 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

賴草屬(LeymusHochst.)是一個(gè)從四倍體至十二倍體類型均有的多倍體物種，其中許多物種[如大賴草(L.racemusus)、羊草(L.chinensis)、多枝賴草(L.multicaulis)等]的染色體核型已經(jīng)非常清楚[1-2]，而濱麥(Leymusmollis)是賴草屬中的一個(gè)四倍體物種，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿[3]、莖稈粗壯和大穗[4]等優(yōu)良性狀，同時(shí)對(duì)小麥條銹病、葉銹病和白粉病等多種真菌病害免疫[5-6]。作為小麥改良育種的重要三級(jí)基因資源[7]，其染色體核型的研究處于空白狀態(tài)，且四倍體賴草屬植物基因組(染色體組)構(gòu)成目前尚未定論。濱麥基因組為NsNsXmXm，其中Ns基因組來自于新麥草(PsathyrostachysKeng)[8-10]，而Xm基因組的來源目前尚未確定。在第2屆國(guó)際小麥族研討會(huì)上(1994年美國(guó)猶他州)，基因組命名委員會(huì)建議使用NsXm作為四倍體賴草屬植物基因組的表示符號(hào)，Xm代表一個(gè)未知的基因組直到試驗(yàn)驗(yàn)證為止[11]。

染色體組型分析可以初步判斷外源染色體是否存在和具體數(shù)目，是植物分類和遺傳研究的重要方法之一。本研究對(duì)濱麥染色體核型進(jìn)行初步分析并繪制濱麥染色體核型模式圖，同時(shí)通過分子標(biāo)記研究其可能的二倍體供體種并分析其與濱麥之間的親緣關(guān)系。

Pedersen等[12]利用FISH技術(shù)結(jié)合重復(fù)序列pAsl和pHvG38，分辨出中國(guó)春和綿陽(yáng)11中的21對(duì)染色體。由于重復(fù)序列探針的準(zhǔn)備耗時(shí)費(fèi)力，部分寡核苷酸探針的發(fā)展為辨別染色體提供了一種更經(jīng)濟(jì)高效的方法。Tang等[13]研究認(rèn)為，兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535代替重復(fù)序列pAsl和pHvG38做雙色FISH，同樣可以清晰準(zhǔn)確地識(shí)別小麥21對(duì)染色體。因此，本研究擬結(jié)合兩種寡核苷酸探針對(duì)普通小麥7182的標(biāo)準(zhǔn)核型進(jìn)行繪制，并利用FISH-GISH技術(shù)對(duì)普通小麥-濱麥高世代衍生系的染色體組成進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)創(chuàng)制和鑒定出更多類型的普通小麥-濱麥種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料包括普通小麥7182(Triticumaestivum，2n=6x=42，AABBDD)，濱麥(L.mollis，2n=4x=28，NsNsXmXm)，華山新麥草(Psathyrostachyshuashanica，2n=2x=14，NsNs)，二倍體長(zhǎng)穗偃麥草(Thinopyrumelongatum，2n=2x=14，EeEe)，擬鵝觀草(Pseudoroegeriaspicata，2n=2x=14,StSt)和百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum，2n=2x=14，EbEb)以及普通小麥-濱麥高世代衍生系M47和M39。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖培養(yǎng)與取材

將供試材料種子腹溝朝下，置于鋪有兩層濾紙的干凈培養(yǎng)皿中，加ddH2O濕潤(rùn)濾紙即可(無多余的水分流動(dòng)為宜)。將培養(yǎng)皿置于23～25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待根長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)，剪取長(zhǎng)約1 cm根尖放入濕潤(rùn)且打孔的普通離心管(1.5 mL)中并編號(hào)記錄，放入笑氣(N2O)罐中密封處理2 h，之后在離心管中加入300 μL 90% 冰乙酸，冰浴固定10 min后，ddH2O沖洗根尖3次，靜置，待離心管完全干燥后，加入70% 冰乙醇，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

濱麥根尖于2015-2017連續(xù)三年在3月下旬至4月上旬取材兩到三次，挖取新生根并剪取約1 cm長(zhǎng)的根尖，置于冰水混合物中處理22～26 h，然后用卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1，v/v)于4 ℃冰箱固定48 h左右，用ddH2O將根尖沖洗至少3次，隨后加入70%冰乙醇，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根尖處理與制片

用ddH2O沖洗70%冰乙醇保存的根尖，用濾紙吸干水分，切取乳白色根尖部分置于裝有2% 纖維素酶和1%果膠酶混合酶液的0.5 mL離心管中，瞬時(shí)離心，待乳白色根尖沉入離心管底部，將離心管放入37 ℃水浴酶解55～60 min(不同材料酶解時(shí)間有所不同)。然后用70% 乙醇沖洗三次，用解剖針將浸潤(rùn)在100 μL 70% 乙醇中的根尖搗碎，6 000 r·min-1離心1～2 min，倒置離心管于濾紙上吸干水分，加40 μL預(yù)冷的純乙酸，高速瞬時(shí)渦旋3次，移液槍吸取10 μL懸濁液滴于干凈載玻片上(處于黑暗且濕潤(rùn)的盒子)，5 min后待懸濁液緩慢均勻擴(kuò)散后于顯微鏡下鏡檢并拍照。

1.2.3 染色體核型分析與模式圖繪制

根據(jù)李懋學(xué)等[14]關(guān)于植物核型的分析標(biāo)準(zhǔn)，選取30個(gè)以上染色體形態(tài)和分散較好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，精選五個(gè)細(xì)胞進(jìn)行拍照。利用圖象處理軟件Adobe Photoshop CS6進(jìn)行細(xì)胞背景處理，測(cè)量各個(gè)染色體及各臂的相對(duì)長(zhǎng)度，進(jìn)行染色體的配對(duì)，排列建立核型圖。

利用Excel對(duì)染色體的各種參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并繪制出整套染色體的核型模式圖。按照Stebbins[15]的核型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分類。

1.2.4 SSR和EST分子標(biāo)記分析

分子標(biāo)記分析共選用825對(duì)SSR引物和86對(duì)EST引物，SSR和EST引物序列均來自GrainGenes數(shù)據(jù)庫(kù)(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)，由奧科鼎盛生物科技有限公司(北京)合成。采用改良后的CTAB法對(duì)供試材料進(jìn)行總基因組DNA的提取。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括1.0 μL PCR Buffer 緩沖液(含Mg2+)、1.0 μL 0.5 μmol·L-1primers(正、反向引物各0.5 μL)、0.8 μL 0.2 mmol·L-1dNTPs混合液、模板DNA 1.0 μL(200 ng·μL-1)、0.1 μL Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)，ddH2O補(bǔ)充至 10.0 μL。反應(yīng)在熱循環(huán)儀Bio-Rad S1000TM型(California,USA)上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，電泳步驟參照吳金華等[16]的方法，凝膠經(jīng)硝酸銀染色顯影后置于燈箱上觀察、照相并統(tǒng)計(jì)帶型。

1.2.5 雙色FISH-GISH技術(shù)

參照Tang 等[13]的方法，利用英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司(上海)合成的兩種寡核苷酸探針Oligo-pTa535(Tamra-red)、Oligo-pSc119.2(FAM-green)序列，以及濱麥葉片總基因組DNA為探針，先后對(duì)根尖體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)和基因組原位雜交(GISH)分析。濱麥葉片gDNA的提取參照改良后的CTAB法[17]進(jìn)行。使用OLYMPUS BX53(日本)熒光顯微鏡鏡檢，利用系統(tǒng)軟件DP800 CCD、cellSens Standaed 1.8進(jìn)行拍照并用圖像處理軟件Adobe Photoshop CS6分析圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 濱麥染色體核型分析及核型模式圖

鏡檢結(jié)果表明，濱麥根尖的細(xì)胞染色體數(shù)目為28條，即2n=4x=28(圖1a)。利用圖像處理軟件Adobe Photoshop CS6對(duì)染色體及各臂的相對(duì)長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行配對(duì)和排序，繪制濱麥染色體核型圖(圖1b)。計(jì)算染色體長(zhǎng)臂與短臂相對(duì)長(zhǎng)度的比值并確定每一對(duì)染色體所屬類型(表1)，繪制出濱麥染色體核型模式圖(圖1c)。依據(jù)核型標(biāo)準(zhǔn)推測(cè)出濱麥的核型公式為：2n=4x=28=22m(6sat)+6sm，其中m、sm和sat分別代表中間著絲粒染色體、亞中間著絲粒染色體和具有隨體的染色體。

2.2 濱麥染色體核型的歸屬

根據(jù)濱麥各對(duì)染色體的臂比(表1，圖1c)，發(fā)現(xiàn)中間著絲粒染色體和亞中間著絲粒染色體分別有11對(duì)和3對(duì)。依據(jù)Stebbins[15]的染色體核型標(biāo)準(zhǔn)分類方案，即最長(zhǎng)與最短染色體之間的長(zhǎng)度比值<2記為A級(jí)，比值在2～4之間記為B級(jí)，比值>4記為C級(jí)；臂比(長(zhǎng)臂/短臂)>2的比例為0記為I級(jí)，0.01～0.5記為II級(jí)，0.51～0.99記為Ⅲ級(jí)，1.0記為Ⅳ級(jí)。本研究中濱麥最長(zhǎng)和最短染色體的比值為1.98，記為A級(jí)；染色體臂比>2的比例為0.07，記為II級(jí)。因此，濱麥染色體的核型類型為IIA。

箭頭指示濱麥染色體的隨體。

表1 濱麥染色體的相對(duì)長(zhǎng)度(總長(zhǎng)、長(zhǎng)短臂)、臂比及類型

2.3 濱麥染色體組供體種的初步分析

分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果表明，456對(duì)標(biāo)記(包括379對(duì)SSR引物和77對(duì)EST引物)在二倍體華山新麥草、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、百薩偃麥草、擬鵝觀草和四倍體濱麥中表現(xiàn)多態(tài)性(部分結(jié)果如圖2)，58對(duì)標(biāo)記在濱麥和四種二倍體物種中擴(kuò)增帶型完全一致，其余311對(duì)標(biāo)記在濱麥、華山新麥草、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草、擬鵝觀草和百薩偃麥草中無擴(kuò)增條帶或者擴(kuò)增條帶模糊。濱麥染色體組供體種分子標(biāo)記的初步分析結(jié)果表明，在多態(tài)性標(biāo)記中有157對(duì)SSR標(biāo)記和27對(duì)EST標(biāo)記在華山新麥草和濱麥間擴(kuò)增出相同帶型；有52對(duì)SSR標(biāo)記和15對(duì)EST標(biāo)記在百薩偃麥草和濱麥間擴(kuò)增出相同帶型；有62對(duì)SSR標(biāo)記和21對(duì)EST標(biāo)記在二倍體長(zhǎng)穗偃麥草和濱麥間擴(kuò)增出相同帶型；有67對(duì)SSR標(biāo)記和24對(duì)EST標(biāo)記在擬鵝觀草和濱麥間擴(kuò)增出相同帶型。這說明華山新麥草、百薩偃麥草、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草和擬鵝觀草與濱麥擴(kuò)增出相同帶型的標(biāo)記分別占多態(tài)性標(biāo)記數(shù)的40.35%、14.69%、18.20% 和19.96%。

a:Xgpw7574-5B標(biāo)記的PCR結(jié)果；b:Xgwm674-3A標(biāo)記的PCR結(jié)果；M:Marker；1:濱麥；2:華山新麥草；3:百薩偃麥草；4:二倍體長(zhǎng)穗偃麥草；5:擬鵝觀草。

2.4 普通小麥7182的FISH標(biāo)準(zhǔn)核型圖

傅 杰等[18]通過組織培養(yǎng)獲得普通小麥-濱麥的雜種F1植株，經(jīng)秋水仙素處理后與普通小麥品系7182回交獲得了雜種后代。本研究結(jié)合兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535，采用雙色FISH技術(shù)繪制出普通小麥7182所有染色體的FISH標(biāo)準(zhǔn)核型圖(圖3)。

紅色：Oligo-pTa535探針；綠色：Oligo-pSc119.2探針；藍(lán)色：DPAI復(fù)染。

2.5 普通小麥-濱麥高世代衍生系M47和M39的染色體組成

利用寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535對(duì)高世代衍生系M47和M39進(jìn)行順序雙色FISH-GISH鑒定。細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果表明，M47和M39體細(xì)胞染色體數(shù)目均為56條，不同的是，M47中有42條普通小麥染色體，14條雙末端紅色信號(hào)染色體(圖4a)；而M39中有44條普通小麥染色體，其中包含4條4B小麥染色體，僅有12條雙末端紅色信號(hào)染色體(圖5a)，因此，初步推斷雙末端紅色信號(hào)染色體為濱麥染色體。為了進(jìn)一步確認(rèn)雙末端紅色染色體的來源，利用濱麥的總基因組DNA為探針進(jìn)行GISH鑒定，結(jié)果表明，雙末端紅色信號(hào)染色體為濱麥染色體(圖4b、5b)。

a：利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對(duì)M47的FISH分析，顯示42條小麥染色體(已標(biāo)出)及14條雙末端紅色信號(hào)染色體(白色箭頭所指)；b:利用濱麥總基因組DNA 為探針(綠色)在同一張片子上對(duì)M47的GISH分析。以DAPI為復(fù)染劑(藍(lán)色)。

a:利用寡核苷酸探針Oligo-pTa535(紅色)和Oligo-pSc119.2(綠色)對(duì)M39的FISH分析，顯示44條普通小麥染色體(已標(biāo)出)包含4條4B染色體(白色大箭頭所指)及12條雙末端紅色信號(hào)染色體(白色小箭頭所指)；b:利用濱麥總基因組DNA 為探針(綠色)在同一張片子上對(duì)M39的GISH分析。DAPI為復(fù)染劑(藍(lán)色)。

3 討 論

3.1 濱麥核型及染色體組構(gòu)成分析

智 力[19]于2000年報(bào)道了窄穎賴草(L.angustus)、粗穗賴草(L.crassiuculus)、若羌賴草(L.ruoqiangensis)、大賴草(L.ruoqiangensis)和羊草(L.chinensis)等5個(gè)不同賴草屬物種的染色體核型；楊瑞武等[1]于2004年報(bào)道了十一個(gè)賴草屬四倍體物種，包括多枝賴草(L.multicaulis)、分枝賴草(L.ramosus)、沙生賴草(L.arenarius)、鹽生賴草(L.salinus)、密穗賴草(L.condensatus)、新生賴草(L.innovatus)、灰賴草(L.cinereus)、柴達(dá)木賴草(L.pseudoracemosus)、無芒賴草(L.triticoides)、阿克摩林賴草(L.akmolinensis)及賴草(L.secalinus)的染色體核型。分析比較得知，上述賴草屬不同物種均具有隨體染色體，且多數(shù)為中部著絲粒染色體，每個(gè)物種具有數(shù)量不等的近中部著絲粒染色體，其中個(gè)別物種還有少數(shù)的近端部著絲粒染色體。從核型的分類類型來看，除多枝賴草和沙生賴草核型為IIB外，其余物種的核型均為IIA。而葛榮朝等[20]發(fā)現(xiàn)，多枝賴草染色體核型中未出現(xiàn)隨體染色體，這與楊瑞武[1]的研究結(jié)果不一致，造成結(jié)果差異的原因可能與試驗(yàn)材料來源和所采用的試驗(yàn)方法不同以及試驗(yàn)操作過程中的誤差等有關(guān)。

本研究對(duì)四倍體濱麥進(jìn)行了核型分析，核型公式為2n=4x=28=22m(6sat)+6sm，核型類型為ⅡA，可以得出具有隨體的濱麥染色體以中部著絲粒染色體為主，有少數(shù)的近中部著絲粒染色體，這與前人報(bào)道的賴草屬大多數(shù)物種的核型相似。綜合分析，賴草屬不同物種的染色體核型既有相似之處，也有各自的特征差異，這種差異可以作為物種基礎(chǔ)分類的細(xì)胞學(xué)依據(jù)。多態(tài)性分子標(biāo)記在華山新麥草、百薩偃麥草、二倍體長(zhǎng)穗偃麥草和擬鵝觀草與濱麥擴(kuò)增出相同帶型的不同比例初步表明，華山新麥草與濱麥的親緣關(guān)系較其他三個(gè)供體種更近。

3.2 普通小麥7128標(biāo)準(zhǔn)核型及其與濱麥高世代衍生系的染色體組成

本研究利用兩種寡核苷酸探針pSc119.2和pTa-535代替耗時(shí)費(fèi)力的重復(fù)序列pAsl和pHvG38，更加經(jīng)濟(jì)、高效和準(zhǔn)確地繪制出普通小麥7182中21對(duì)染色體的標(biāo)準(zhǔn)FISH核型圖。通過雙色FISH-GISH技術(shù)鑒定出兩種類型的普通小麥-濱麥高世代衍生系M47(2n=56=42T.a+14L.m)和M39(2n=56=44T.a+12L.m)，均可作為創(chuàng)制新的普通小麥-濱麥種質(zhì)資源的中間橋梁材料。本研究為后續(xù)普通小麥-濱麥種質(zhì)資源的創(chuàng)制和鑒定提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)和技術(shù) 方法。