抗赤霉病小麥優異新種質的分子標記輔助選擇

李靜靜，史娜溶，楊孟于，王金鵬，孫道杰，馮 毅，張玲麗

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是小麥生產中具有毀滅性的病害，近10年來在中國黃淮麥區大面積流行[1-3]。赤霉病主要危害小麥穗部，嚴重影響產量，感病籽粒含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等毒素，食用或飼用后會引發中毒[4]，直接威脅糧食安全和食品安全?？钩嗝共⌒缕贩N的選育及其推廣利用是控制病害發生和蔓延的最經濟有效的措施[1]。在中國黃淮麥區以往的小麥育種中，赤霉病抗性未被作為主要育種目標[5]，致使目前大田主要推廣品種的赤霉病抗性普遍較差[6]。赤霉病免疫或高抗種質資源在全世界較為稀缺[7]，因此，創制抗赤霉病新種質是當前黃淮麥區抗病育種的主要育種目標[2]。在國內外研究的40多個抗赤霉病種質資源材料中，中國小麥地方品種蘇麥3號是目前全世界公認的高抗赤霉病優異種質資源[7]。蘇麥3號含有多個抗赤霉病的QTLs，分別位于3BS、5AS和6BS等染色體上[7-8]，其中，位于3BS染色體上的主效基因Fhb1(即Qfhs.ndsu-3BS)[9-10]抗擴展效應最強，被廣泛研究和利用[5,7]，該基因可解釋表型變異的24.5%～60.0%[11-13]；已開發的Fhb1基因連鎖標記有gwm533、gwm493、barc133、umn10和barc147等[10,14-17]。位于蘇麥3號6BS染色體上的抗赤霉病微效基因Fhb2可解釋赤霉病抗性表型變異的 9.4%～21.0%[15,18]，該位點開發的可利用標記有gwm133、barc101和gwm644[11,15,18]。位于5AS染色體臂上的基因Fhb5(即Qfhi.nau-5A)與抗赤霉病菌侵染密切相關[19]，可解釋赤霉病抗性表型變異的20.0%左右[14]，已開發的連鎖標記有barc186、barc180、gwm304、wmc705、gwm293和gwm154[12,14,20-21]。位于蘇麥3號3BS、5AS和6BS染色體上的這些抗赤霉病基因分子標記，可用于抗病育種的分子標記輔助選擇[7]。但是，蘇麥3號春性較強，易受凍害；株高120 cm左右，莖稈纖細易倒伏，農藝性狀差，產量低；籽粒粉質，品質較差[22-23]，在黃淮冬麥區直接利用難度較大[5]。

小麥新品系979-5是從黃淮麥區主推品種西農979中系選的矮稈品系，株高(75 cm左右)較西農979低，抗倒伏，具有西農979的早熟抗寒和優質強筋特性，但中感赤霉病。為此，本課題組通過979-5與蘇麥3號雜交組合，采用系譜育種法，結合利用分子標記輔助選擇技術和赤霉病菌接種鑒定技術，選育兼抗赤霉病的優良育種材料，以期為黃淮麥區抗赤霉病小麥新品種改良提供優異親本材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本課題組于2012年以979-5與蘇麥3號為親本進行雜交，2013年田間種植F1群體，2014年在F2代群體中選擇優良單株，2015-2019年分別種植F3～F7并從中選株系。每年同步種植對照材料矮抗58(高感赤霉病)，親本材料979-5(中感赤霉病)和蘇麥3號(高抗赤霉病)。參試材料于每年10月5日播種于西北農林科技大學小麥育種試驗田：F1種植106株，F2種植12 420株，F3～F7每個株系種植3行。播種規格：株距6.67 cm，行距27.0 cm，行長200 cm。小麥生長期間不進行病害防治，其余管理同大田。

所用赤霉病病原菌菌種分離自陜西關中灌區田間禾谷鐮刀菌強致病菌系，在滅菌的小米粒上擴繁，菌種由西北農林科技大學植物保護學院王保通教授惠贈。

1.2 方 法

1.2.1 主要農藝性狀調查

調查的主要農藝性狀有幼苗抗寒性、株高、開花期、成熟期、單株成穗數、穗長和小穗數等。在植株生長發育期間，進行觀察記載，并對性狀表現優異單株掛牌標記。

1.2.2 赤霉病接種和病情鑒定

于小麥揚花期，將培養好的帶菌米粒接種于麥穗中上部第4或第5個小穗(從穗頂部往下數)最外邊的一個小花內。接種后，立即用裝有蒸餾水的噴壺噴濕接種穗，并用塑料袋套袋保濕 72 h。單株鑒定時，每個單株接種3個單穗；品系鑒定時，每個品系隨機接種20個單穗。

參照中國小麥抗赤霉病評價技術規范[24]，于接種21 d后，調查每個接種穗部的發病小穗數和總小穗數，計算嚴重度。依據平均嚴重度，將材料可分為5個抗性等級：免疫(I)(平均嚴重度為0)，高抗(HR)(0 <平均嚴重度< 2.0)，中抗(MR)(2.0 <平均嚴重度≤3.0)，中感(MS)(2.0<平均嚴重度≤3.5)，高感(HS)(平均嚴重度 ≥3.5)[24]。

1.2.3 DNA標記分析

取苗期小麥幼嫩葉片，按照Edwards等[25]的CTAB法提取基因組DNA。選用與蘇麥3號抗赤霉病基因Fhb1、Fhb2和Fhb5緊密連鎖的13個SSR標記進行分析，即：3BS上Fhb1的4標記(gwm493、barc133、gwm533和barc147)[11,16,26]，6BS上Fhb2的3個標記(gwm133、gwm644和barc101)[19]，5AS上Fhb5的6個標記(barc186、barc180、wmc705、gwm293，gwm154和gwm304)[12,14,21,27]。引物由北京迪寧生物科技有限公司合成。

PCR反應總體系為15 μL，包括：1.5 μL 10× PCR buffer，0.3 μL dNTPs Mixture(10 mmol·L-1)，0.4 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U · μL-1)，2 μL引物(上、下游引物各1 μL，5 μmol·L-1)，2 μL模版DNA(50 ng·μL-1)，8.8 μL dd H2O。PCR反應擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55～60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃后延伸 10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.4 籽粒品質分析

收獲的籽粒晾曬干燥并室內常溫貯藏1月后，利用近紅外透射谷物分析儀(型號InfratecTM 1241，福斯有限公司，中國)測定籽粒含水量、蛋白質含量(干基)、濕面筋含量(14%水分基)、面粉吸水率、面團穩定時間和沉降值等指標。

通過一年的肥效對比試驗數據積累、比較可以看出：肥料合理配比和提高肥料利用率是作物高產穩產的關鍵，使用配方專用肥是解決這一問題的有效手段，同時可以改善土壤養分供給，滿足作物對養分的需求，從而達到增產增收的目的，因此，建議在今后的生產中應推廣專用配方肥[2]。

1.2.5 數據處理與分析

利用SPSS 19.0數據統計分析軟件進行方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 分子標記在兩親本間的多態性

選用13個SSR標記對親本979-5和蘇麥3號進行擴增分析，其中6個標記(3BS上的gwm493，6BS上的gwm133和gwm644，5AS上的gwm293、barc186和gwm304)在兩親本間擴增為單態(圖1A)，其余7個標記(3BS上的barc133、gwm533和barc147,6BS上的barc101,5AS上的barc180、wmc705和gwm154)在兩親本間擴增均為多態(圖1B)。這表明，979-5與蘇麥3號在3BS、6BS和5AS三個抗赤霉病基因位點具有一定的遺傳相似性。因此，選用7個多態性標記可對979-5和蘇麥3號的后代群體的3個抗性基因位點進行選擇。

2.2 抗赤霉病新品系創制結果

采用系譜育種法，從12 420個單株組成的F2代群體中，依據農藝性狀表現選到545個優良單株。按株系種植F3～F5世代群體，根據農藝性狀表現，在優良株系內選擇優良單株，對初選單株用3BS上的3個多態性標記(gwm533、barc133和barc147)分別進行分析(圖2A)，發現這3個標記位點均能擴增出與蘇麥3號相同帶型的單株。經2018和2019年連續兩年標記檢測和農藝性狀分析，最終育成穩定遺傳且含有3BS上Fhb1基因標記位點的新品系20個(表1)。

2.3 新品系在5AS和6BS標記位點的差異

用5AS上的多態性標記(barc180、wmc705和gwm154)和6BS上的多態性標記(barc101)(圖2B，C)，分別對育成的14個新品系進行分析。結果發現，有5個品系(k11、k12、k13、k14和k15)在三個標記位點(wmc705、gwm154和barc101位點)檢測到蘇麥3號的特異條帶；有2個品系(k9和k10)在兩個標記位點(wmc705和gwm154位點)檢測到蘇麥3號特異條帶；其余13個品系在5AS和6BS的3個多態性標記位點均未檢測到蘇麥3號的特異條帶(表1)。由此可見，k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15這7份材料不僅聚合有3BS上的優異等位變異，還聚合有5AS和6BS上的優異等位變異；其余13份材料僅聚合了3BS上的優異等位變異。

A、B、C圖分別為分子標記barc133、wmc705、barc101的檢測結果。1：979-5；2：蘇麥3號；箭頭分別示979-5和蘇麥3號的特征 譜帶。

2.4 新品系的赤霉病抗性

經2018-2019連續兩年田間赤霉病單花接種鑒定，20個新品系抗性水平表現穩定可靠，其中高抗品系有7個(k9、k10、k11、k12、k13、k14和k15)，中抗新品系有13個(表1，圖3)。

箭頭指示接種赤霉病菌的小花部位。

表1 赤霉病抗性評價及分子標記分析

2.5 新品系的主要農藝性狀

表2 新品系的主要農藝性狀

2.6 新品系的主要品質性狀

育成的20個新品系四項品質指標(蛋白質含量、濕面筋含量、吸水率和穩定時間)普遍優于蘇麥3號(表3)。其中，k15、k32和k40三個品系的蛋白質含量為14.1%～14.6 %、濕面筋含量為30.2%～31.2%、面粉吸水率為58.4%～ 60.8%，面團穩定時間為7.4～8.0 min。在國家中強筋小麥品種標準[28]中要求，蛋白質含量≥13%，濕面筋含量≥28.5%，吸水率≥58%，穩定時間≥7.0 min?？梢?，新品系k15、k32和k40的四個主要品質指標達到國家中強筋小麥品種 標準。

表3 新品系的籽粒主要品質指標

3 討 論

近年來，隨著全球氣候的變化和作物耕作制度的改變，中國小麥赤霉病發病區域呈擴大趨勢，已從長江中下游麥區擴展到黃淮麥區[5,29]，嚴重影響中國小麥生產安全。培育抗赤霉病品種已成為中國黃淮麥區小麥育種的主要目標之一[5]。蘇麥3號攜帶有多個抗赤霉病基因/QTLs[7,17]，是世界上公認的高抗赤霉病品種，其抗性強且穩定持久。美國、加拿大、澳大利亞等國家利用其Fhb1、Fhb2和Fhb5基因連鎖分子標記輔助選擇技術[26,30-32]，開展抗赤霉病小麥新品種改良。本研究采用系譜選育法，對979-5品系與蘇麥3號雜交后代群體，利用分子標記輔助選擇技術和赤霉病菌單花接種鑒定技術，結合農藝性狀選擇，育成攜帶有Fhb1基因的抗赤霉病優異新品系20份，其中13份新品系僅攜帶Fhb1基因，其抗性水平表現為中抗；5份新品系(k11、k12、k13、k14和k15)不僅攜帶有Fhb1，還攜帶有Fhb2和83.3%Fhb5的優異等位變異，抗性水平為高抗；2個新品系(k9和k10)，不僅攜帶有Fhb1，還攜帶有Fhb5的83.3%優異等位變異，抗性水平為高抗。由此可見，利用蘇麥3號抗性基因分子標記輔助選擇時，聚合的抗性基因或優異等位變異數越多，抗性水平越強。Basnet等[33]研究認為，蘇麥3號之所以抗性最強和持久，可能與其擁有較多數量的微效QTLs有關。Bai等[34]研究表明，僅僅聚合有Fhb1的材料，并不能完全保護和抵抗赤霉病的危害。這表明，在利用抗赤霉病分子標記輔助選擇時，為了提高赤霉病的抗性水平，不僅要進行主效基因Fhb1的標記輔助選擇，還需要進行微效基因的標記輔助選擇。

本研究之所以能在育成品系的5份材料(k11、k12、k13、k14和k15)中，能同時聚合Fhb1和Fhb2的全部優異等位變異、以及83.3%Fhb5的優異等位變異，與親本材料979-5在這三個基因位點的遺傳基礎有關。利用與Fhb1、Fhb2和Fhb5基因緊密連鎖的13個SSR標記分析發現，979-5與蘇麥3號在這三個基因位點具有較高的遺傳相似性：用Fhb1的4個SSR標記(gwm493、barc133、gwm533和barc147)分析發現，其中1個標記(gwm493)在979-5和蘇麥3號間擴增帶譜相同；用Fhb2的3個標記(gwm133、gwm644、barc101)分析發現，有2個標記(gwm133和gwm644)在979-5和蘇麥3號間擴增帶譜相同；用Fhb5的6個標記(barc186、barc180、wmc705、gwm293，gwm154和gwm304)分析，其中3個標記(gwm293、barc186和gwm304)在979-5和蘇麥3號間擴增帶譜相同。這表明，979-5與蘇麥3號在Fhb1、Fhb2和Fhb5基因位點遺傳相似性分別為25.0%、66.7%和50.0%。979-5源自小麥品種西農979，西農979是蘇麥3號的衍生系，攜帶有蘇麥3號的Fhb1基因[35]，因此推測，979-5之所以中感赤霉病，可能與其攜帶蘇麥3號抗性相關的優異等位變異有關。由于979-5在Fhb1、Fhb2和Fhb5位點與蘇麥3號有較高的遺傳相似度，本研究在利用主效基因Fhb1分子標記輔助選擇的同時，能有效地聚合微效基因Fhb2和Fhb5位點的部分優異等位變異，其中育成的5個新品系(k11、k12、k13、k14和k15)赤霉病抗性均達高抗水平。本研究在分子標記輔助選擇和赤霉病菌接種鑒定的同時，還進行了主要農藝性狀和品質性狀的選擇，育成的新品系不僅對赤霉病抗性得到有效提高，而且豐產性和品質性狀也獲得提升，因此本研究育成的新品系可作為黃淮麥區小麥新品種改良的優異親本材料。