人工草地土壤有機碳組分與微生物群落對施氮補水的響應

徐夢，徐麗君，程淑蘭，方華軍，，盧明珠，于光夏，楊艷，耿靜，曹子鋮，李玉娜

人工草地土壤有機碳組分與微生物群落對施氮補水的響應

徐夢1，徐麗君2，程淑蘭3，方華軍1，3，盧明珠1，于光夏3，楊艷1，耿靜1，曹子鋮3，李玉娜3

（1中國科學院地理科學與資源研究所生態網絡觀測與模擬重點實驗室，北京 100101；2中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/呼倫貝爾草原生態系統國家野外科學觀測研究站，北京 100081；3中國科學院大學資源與環境學院，北京 100049）

【】人工草地建設是緩解天然草地放牧壓力、促進退化草地恢復的有效方式。開展施氮和補水對呼倫貝爾人工草地土壤有機碳（SOC）組成、土壤微生物群落數量和活性變化的研究，以深入認識不同管理方式對人工草地土壤碳截存及其穩定性的影響及調控機制。在3種人工草地種植模式（紫花苜蓿單播、無芒雀麥單播及苜蓿-無芒雀麥混播）下構建施氮（0、150kg N·hm-2·a-1）和補水（0、60 mm）雙因素試驗，采集各處理土壤樣品，使用SOC物理分組、磷脂脂肪酸（PLFA）分析以及土壤酶活性測定，分析不同水氮處理對SOC組分以及土壤微生物數量、組成和活性的影響，揭示土壤微生物群落組成或活性與SOC組分的耦聯關系。3年的施氮和補水處理顯著影響不同土壤有機碳組分的含量。施氮處理整體上增加了苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地土壤的顆粒態有機碳（POC）含量，但是降低了礦物結合態有機碳（MAOC）的含量，而旱季補水則顯著提高了無芒雀麥單播草地土壤粗顆粒態有機碳的含量。施氮和補水對土壤微生物群落數量和組成沒有產生顯著影響，但是顯著影響了4種土壤酶的活性。單施氮處理顯著降低β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）在苜蓿單播草地土壤中的活性，但是顯著提高其在無芒雀麥單播草地土壤中的活性。單補水處理顯著降低了苜蓿單播和無芒雀麥單播草地土壤的纖維二糖水解酶（CB）和NAG活性。補水+施氮處理顯著降低苜蓿單播草地土壤中β-葡萄糖苷酶（βG）、CB和NAG的活性，但顯著提高苜蓿-無芒雀麥混播草地土壤中CB活性。不同水氮處理下土壤總PLFA及各微生物類群PLFA的變化量與POC變化顯著正相關，而與MAOC顯著負相關。βG和CB活性以及土壤酶C/N比、C/P比的變化量則與POC變化量負相關，并且在補水情況下更為顯著。在呼倫貝爾半干旱區人工草地，施氮顯著促進土壤活性碳組分積累、降低惰性有機碳組分含量，不利于土壤碳庫的穩定性。補水和施氮顯著影響了土壤微生物群落的活性，并且不同水氮處理下土壤酶化學計量比的變化與土壤有機碳組分變化密切相關。這些結果表明人工草地土壤微生物對碳、氮、磷養分需求的差異是調控活性有機碳組分周轉的重要驅動力。

人工草地；施氮；補水；土壤有機碳；土壤微生物；土壤酶活性；酶化學計量比；呼倫貝爾

0 引言

【研究意義】由于氣候變化、過度放牧以及人類活動等因素的作用，目前我國接近90%的天然草地面臨著退化的威脅[1]，而建設優質高效的人工草地能夠有效緩解天然草地的放牧壓力，從而有助于退化草地以及區域生態環境的恢復。草地生態系統的土壤有巨大的固碳潛力[2]，而施肥、灌溉等常見的草地管理方式對草地土壤有機碳（SOC）周轉動態有顯著影響，進而影響草地生態系統碳、氮等元素的生物地球化學循環過程[3-4]。土壤微生物是生態系統功能發揮和生物地球化學循環的驅動者，不同草地管理方式下土壤微生物群落數量和功能的差異可能對草地SOC固持以及土壤碳氮循環過程產生顯著影響。因此，開展施肥、灌溉等管理方式對人工草地SOC組成以及土壤微生物群落組成和活性的研究，有助于深入認識和闡明不同管理方式在人工草地生產力、穩定性以及生態系統多功能性等方面的調控機制和相對重要性，并為逐步完善我國人工草地功能調控的理論基礎提供科學試驗依據?！厩叭搜芯窟M展】施肥（尤其是氮肥）有提升草地土壤有機碳固持的潛力[3,5-6]，但是也有研究表明氮素富集對草地SOC的影響并不唯一[7]。通過物理或化學分組方法，SOC能夠被分解為多個功能性或者生物組成上不同的組分[8]，這些組分通常具有不同的周轉速率[9]，因而能夠更加敏感的反映出管理方式對草地SOC的影響并有助于揭示其調控機制。例如，吸附在土壤礦物顆粒表面的有機碳（礦物結合態有機碳，MAOC）較難被微生物利用從而比較穩定，而顆粒態有機碳（POC）主要包含未分解或半分解的植物殘體，因而較為容易被微生物分解利用[10]。RIGGS等[11]發現，施氮對SOC組分有顯著影響，但是不同SOC組分的響應有差異。并且，近期研究發現SOC對氮素富集的響應主要取決于物理（團聚體結合態SOC）或化學保護機制（MAOC），而非SOC的化學組成（分子構成）[12-13]。因此，研究人工草地不同SOC組分對施氮的響應有助于深入理解管理措施對人工草地土壤碳固持和周轉的影響。除了直接影響SOC組分，施氮能夠通過影響土壤微生物數量、活性以及與碳循環的相關過程或功能，進而影響SOC的積累或耗損[14-16]。土壤微生物能夠分為貧營養型（或者-策略）以及富營養型（或者-策略），而不同功能類型的微生物在生物量周轉和SOC分解效率上有明顯差異[17]。因此，不同土壤微生物功能類群對施肥和灌溉等管理方式的響應差異可能對草地土壤碳循環和SOC固持產生顯著影響[18-19]。目前對施氮和灌溉對土壤微生物群落數量和組成的影響已有許多報道，但是結論不一。例如，施氮或補水能降低真菌和細菌的比值（F/B）[20-21]以及革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的比值（G+/G-）[22]，但是也有研究發現土壤微生物群落組成不受施氮和補水的影響[23-24]。除了數量和組成，土壤微生物分泌的胞外酶也會受到施氮或灌溉的影響[21,25]。土壤胞外酶是土壤有機質分解的關鍵媒介，其活性、產量以及酶生態化學計量比值（即獲取碳、氮、磷的主要胞外酶比值）與碳源底物及氮、磷養分有效性密切相關，能夠反映微生物群落的養分需求與環境養分之間的生物地球化學平衡狀況[26]。目前對天然草地土壤微生物如何響應施氮和補水已有一定研究[15,21,27]，但是對人工草地的關注十分有限，急需開展相應研究?！颈狙芯壳腥朦c】作為常用的提升人工草地產量的重要管理措施，施肥和灌水能夠通過改變土壤養分有效性而影響土壤微生物群落的組成或功能，進而影響微生物對SOC的分解作用，最終導致人工草地SOC的積累或耗損。然而，不同SOC組分以及微生物類群對施氮和補水的差異性響應，以及微生物群落特征（數量、組成及功能）與SOC周轉動態的耦聯關系，亟需要進行深入分析?！緮M解決的關鍵問題】本研究在內蒙古呼倫貝爾人工草地水氮添加控制試驗平臺采集土壤樣品，利用物理法對具有不同周轉和穩定性的有機碳組分進行分組，同時利用磷脂脂肪酸法（PLFA）和酶標儀法測定土壤微生物群落組成和活性，明確施氮、補水及其交互作用對人工草地SOC組分及土壤微生物的影響，并探討土壤微生物數量或活性與SOC組分的耦聯關系，以闡明施氮和補水對呼倫貝爾人工草地土壤碳固持的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 采樣區域自然概況及試驗設計

本研究在呼倫貝爾國家野外站（N 49°6′—49°32′，E 119°32′—120°35′）的人工草地試驗平臺進行。該地區屬于中溫帶半干旱大陸性氣候，年平均氣溫為-2.4℃，年平均降水量為320 mm（2000—2010年），主要集中于植物生長旺季（7—9月）。土壤以黑鈣土為主，有機質含量約51 g·kg-1。水氮添加控制試驗平臺建立于2015年，使用雙因素裂區試驗設計。主區處理為牧草種植模式：（1）紫花苜蓿（L.）單種；（2）無芒雀麥（Leyss）單種；（3）紫花苜蓿和無芒雀麥1﹕1混播。副區為水氮處理：（1）對照CK（N0+W0），未施氮和補水；（2）N（N150+W0），施氮肥150 kg N·hm-2·a-1，無補水；（3）W（N0+W15），旱季補水（年平均降水量的15%），不施氮；（4）N+W（N150+W15），施氮肥150 kg N·hm-2·a-1，且旱季補水。4次重復，隨機排列，共48個試驗小區。每個試驗小區的面積為7 m×10 m，行距0.5 m。使用氮肥為尿素（化學純，含氮量46%），每年在牧草返青期和開花期分別施50%。補水的處理小區在6、7、8月每月補水20 mm，全年共補水60 mm。

1.2 土壤樣品采集

本研究中土壤樣品的采集在2018年7月進行。在每個試驗小區中，使用土鉆（直徑2.5 mm，深10 mm）隨機采集5—10鉆土壤混合為一個樣品。將采集的土壤樣品挑出可見的石塊、土壤動物和植物殘體后，過2 mm篩并混合均勻。分取一部分混合均勻的土壤樣品，用于提取微生物磷脂脂肪酸的保存在-20℃；用于測定土壤酶活性、土壤NH4+-N、NO3--N及總可溶性氮（TDN）含量的保存在4℃冰箱里；用于測定SOC分組及其他指標的在室溫下風干后保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤pH使用pH計（Mettler Toledo，Switzerland）測定，土水比為1﹕2。土壤有機碳（SOC）和總氮（TN）含量用元素分析儀（vario EL III, Elementa，Germany）測定。土壤NH4+-N、NO3--N及總可溶性氮（TDN）含量的測定使用2 mol·L-1KCl浸提，用Whatman #1濾紙進行過濾，之后使用流動分析儀（AA3，SEAL，Germany）進行測定。土壤水分用105℃烘干前后土壤重量的變化進行計算。

1.3.2 土壤有機碳（SOC）分組方法 使用濕篩法將SOC根據顆粒大小分為不同的組分，具體操作根據CAMBARDELLA等[10]的方法進行。首先，將50 g土壤風干樣品裝入聚碳酸酯硬塑料瓶中，加入100 mL 1%六偏磷酸鈉溶液，密封后于200 r/min轉速下振蕩過夜。將土壤分散液置于250 μm和53 μm的套篩上，下面放置一個大燒杯，用去離子水沖洗篩上樣品直至水流清晰不含細土顆粒為止。留在250 μm篩上的為粗顆粒有機碳（coarse POC，＞250 μm），留在53 μm篩上的為細顆粒有機碳（fine POC，53—250 μm），顆粒態有機碳（POC）即為兩個組分之和；沖洗進大燒杯的為礦物結合態有機碳（MAOC，＜53 μm）。用去離子水沖洗各級篩子上的殘留樣品至預先稱重的容器中，于60℃烘干并稱重。各有機碳組分的碳含量使用元素分析儀測定。

1.3.3 磷脂脂肪酸（PLFA）測定 土壤中PLFAs的提取根據FROSTEG?RD和B??TH[28]的方法進行并稍作改進。首先將5 g凍干土壤樣品用19 mL提取液（氯仿﹕甲醇﹕檸檬酸緩沖液（pH 4.0）= 1﹕2﹕0.8）提取土壤樣品中的全部脂肪酸。將提取的脂肪酸樣品加入硅膠固相萃取柱，分別用6 mL氯仿、6 mL丙酮和3 mL甲醇對硅膠萃取柱進行連續洗脫，PLFA組分被收集在甲醇相中。之后用1 mL的1﹕1甲醇甲苯溶液和1 mL KOH甲醇溶液（0.2 mol·L-1）將PLFA組分進行甲基化，反應生成磷脂脂肪酸甲酯（FAME）。制備好的磷脂脂肪酸甲酯樣品在上樣前加入脂肪酸19:0作為內標，使用氣相色譜儀測定脂肪酸含量，并用微生物鑒定系統MIDI Sherlock 6.1（MIDI Inc., Newark, DE）標定每種脂肪酸的名稱。

各種PLFA指示的微生物類群參考FROSTEG?RD和B??TH[28]。提取PLFAs的總量用來表征總的微生物量。革蘭氏陽性細菌用同型（iso-）和異型（anteiso-）的支鏈飽和脂肪酸（i14:0、i15:0、a15:0、i16:0、i17:0、a17:0）表征；革蘭氏陰性細菌用直鏈飽和脂肪酸（14:0、15:0、17:0）、單不飽和脂肪酸（16:1ω7c、18:1ω5c）以及環丙基脂肪酸（cy17:0、cy19:0）表征；真菌用脂肪酸18:2ω6, 9c和18:1ω9c表征，叢枝菌根（AM）真菌用16:1ω5c表征。

1.3.4 土壤酶活性測定 使用酶標儀法測定β-葡萄糖苷酶（βG）、纖維二糖水解酶（CB）、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和酸性磷酸酶（AP）的活性，使用傘形酮（MUB）作為標示底物（表1）。稱取1 g土壤于廣口瓶中，加入125 mL 50 mmol·L-1醋酸緩沖液（pH＝5.0），用磁力攪拌器攪拌5 min。攪拌后用移液器取200 μL懸浮液加入到96孔微平板中，在黑暗中20℃下培養4 h。培養結束后，向每個微孔中加入10 μL 1 mol·L-1NaOH溶液終止反應，之后用多功能酶標儀測定每個微孔的熒光度。

1.3.5 數據分析 使用單因素方差分析（ANOVA）分析不同水氮添加處理對土壤理化性質、SOC組分、土壤微生物PLFA以及酶活性的影響，并用雙因素方差分析比較施氮、補水以及兩者的交互作用對這些指標的影響。使用配對T檢驗（Paired t-test）檢驗兩個處理之間差異的顯著性（在＜0.05水平下）。使用Pearson相關性分析不同水氮處理下SOC組分變化與土壤微生物PLFA及酶活性變化的相關性，以揭示土壤微生物數量和功能與SOC組分的耦聯關系。所有統計分析均使用IBM SPSS Statistics（version 22.0）進行。

表1 土壤酶測定種類及其底物

2 結果

2.1 土壤氮素有效性及理化性質

在3種種植模式的人工草地經過3年水氮處理，其土壤中SOC、TN、NH4+-N的含量，以及土壤水分含量均沒有顯著變化，但是均顯著提高了土壤中NO3--N和可溶性氮（TDN）含量（表2）。在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地，N處理和N+W處理的土壤NO3--N含量均顯著高于對照處理CK，平均分別增加了1.0—1.4倍和1.6—1.9倍，而在無芒雀麥單播草地，僅N處理的土壤NO3--N含量比CK平均增加了1.8倍。W處理下土壤NO3--N含量在3種人工草地中均與CK處理之間沒有顯著差異（＞0.05）。土壤TDN含量的變化與NO3--N含量變化大體相同。

表2 3種牧草種植模式下不同水氮處理的土壤理化特征

數據表示為每種牧草種植模式下的平均值±標準誤差。不同的小寫字母表示各指標在不同水氮處理之間差異顯著（＜0.05）。表3、表4同

Data are presented by mean value ± SE. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments by Duncan’s multiple range tests (＜0.05). The same as Table 3, Table 4

2.2 土壤有機碳組分

在3種種植模式的人工草地，不同水氮處理對SOC總量沒有產生顯著影響（表2）。通過濕篩法分離出的3種SOC組分中，MAOC的含量在3種人工草地土壤中平均為11.5 mg·kg-1，約占SOC總量的50%以上；而coarse POC和fine POC的含量平均分別為3.2 mg·kg-1和6.9 mg·kg-1，明顯低于MAOC。在苜蓿單播草地，3個水氮處理下coarse POC含量均顯著低于CK處理，平均減少了27.3%—38.2%；fine POC和MAOC的含量均在N處理下與CK有顯著差異，分別平均增加了64.6%和降低了20.7%（圖1）。在無芒雀麥單播草地，coarse POC組分含量在W處理下顯著高于CK處理，平均增加了98.7%，而其余兩個SOC組分在不同水氮處理下沒有顯著差異。在苜蓿-無芒雀麥混播草地，coarse POC組分含量在N處理下顯著高于CK處理，平均增加了一倍；MAOC組分含量在N處理下最低，且顯著低于N處理，但與CK處理沒有顯著差異（＞0.05），相比于CK平均減少了38.3%。

不同的小寫字母表示各SOC組分在不同水氮處理之間有顯著差異（P＜0.05）

2.3 土壤微生物數量及其群落組成

在兩種單播模式的人工草地，不同水氮處理下其土壤微生物群落總PLFA含量以及各微生物類群PLFA含量均無顯著差異（表3）。在苜蓿-無芒雀麥混播草地，土壤微生物總PLFA、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌以及叢枝菌根真菌PLFA含量均以N處理的最高，但與CK處理并無顯著差異，均以N+W處理的最低，并且均顯著低于N處理。水氮處理后盡管土壤F/B和G+/G-均沒有顯著差異，但在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地，施氮傾向于增加F/B和降低G+/G-，無芒雀麥單播則傾向于降低F/B。

2.4 土壤酶活性及酶化學計量比

在3種種植模式的人工草地，在不同水氮處理下參與土壤碳（βG、CB）、氮（NAG）和磷（AP）轉化的4種土壤胞外酶的活性均有顯著差異，但是其影響的程度和方向則不盡相同（圖2）。對于碳轉化相關胞外酶，在苜蓿單播草地，旱季補水顯著降低βG和CB的活性，W處理和N+W處理的βG和CB活性均與CK處理差異顯著，平均分別降低了31.4%—67.5%和45.5%—88.6%；在苜蓿-無芒雀麥混播草地，CB活性在N+W處理顯著高于CK，平均提高了72%。對于氮轉化酶，在苜蓿單播草地，3個水氮處理下NAG活性均顯著低于CK，平均降低了35.7%—71.5%；在無芒雀麥單播草地，N處理下NAG活性顯著高于CK，平均增加了31.4%，而W處理則顯著降低NAG活性，平均降低了40.5%；而在苜蓿-無芒草地雀麥混播草地，N+W處理下NAG的活性最高，且顯著高于W處理，但是與CK差異不顯著（＞0.05）。對于酸性磷酸酶（AP），其活性在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地不同水氮處理下沒有顯著差異，但是在無芒雀麥單播草地其活性在N處理下最高，且顯著高于W處理，但與CK差異不顯著（＞0.05）。

在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地，不同水氮處理下土壤酶化學計量比差異顯著，但在無芒雀麥單播草地無顯著差異（表4）。在苜蓿單播草地，N處理的βG/NAG和CB/NAG顯著高于CK處理，平均增加了91.7%和97.0%；W處理的βG/NAG也顯著高于CK，平均增加了57.2%。在苜蓿-無芒雀麥混播草地，N+W處理下CB/AP最高，且顯著高于CK處理，平均增加了73.5%；CB/NAG也在N+W處理下最高，但是與CK處理沒有顯著差異，僅顯著高于N處理。

表3 3種牧草種植模式下不同水氮處理中土壤PLFA含量（μmol·g-1）

表4 3種牧草種植模式下不同水氮處理后的土壤酶化學計量比

柱狀圖表示為平均值±標準誤差。不同的小寫字母表示各土壤酶活性在不同水氮處理之間有顯著差異（P＜0.05）

2.5 土壤PLFA含量和酶活性與SOC組分的耦聯關系

相關分析結果表明，水氮處理后3種種植模式的人工草地土壤總PLFA含量的相對變化量（Δ）與POC相對變化量有顯著正相關關系（=0.486，＜0.05），而與MAOC呈顯著負相關關系（= -0.657，＜0.01），且在補水和不補水情況表現一致（表5）。其他土壤微生物類群PLFA的相對變化量與SOC組分的相關關系與總PLFA大體相同。兩種碳轉化相關土壤酶βG和CB活性的相對變化量與coarse POC（不補水情況下）和POC（補水情況下）的相對變化量顯著負相關，而與MAOC顯著正相關。土壤酶生態化學計量比的變化主要與POC組分的變化有相關性關系：coarse POC的變化與CB/NAG顯著負相關（不補水情況下=-0.691，＜0.05）；fine POC的變化與βG/AP顯著負相關（= -0.463，＜0.05），且在補水情況下相關性更高（= -0.797，＜0.01）。在補水情況下，βG/AP和CB/AP的變化與POC顯著負相關，且βG/NAG和CB/NAG的變化也與POC有負相關關系（邊緣顯著＜0.1）。回歸分析結果也表明，土壤酶C/N、C/P的平均變化在補水情況下均與POC的平均變化有正相關關系（圖3）。

表5 水氮處理下土壤PLFA含量、酶活性及SOC組分相對變化量的相關性分析

相對變化量（Δ）的計算為（施氮處理-不施氮處理）/不施氮處理，不補水情況下Δ＝（N處理-CK處理）/CK處理，補水情況下Δ＝（N+W處理-W處理）/W處理。?＜0.1；*＜0.05；**＜0.01。＞0.1的數值表示為“—”

Relative change (Δ) was calculated as the relative changes between treatments with N addition and treatments without N addition. For treatments with no water addition, Δ=(N-CK)/CK. For treatments with water addition, Δ={(N+W)-W}/W. ?＜0.1; *＜0.05; **＜0.01. Values with＞0.1 are presented with a short dash

3 討論

前人研究表明，施氮能夠顯著影響天然草地土壤微生物群落的數量和組成[15,21,27]。然而，在呼倫貝爾半干旱地區經過3年的施氮試驗并沒有對人工草地土壤微生物總量以及各微生物類群生物量產生顯著的影響（表3）。這可能是由于施氮沒有對土壤pH值產生顯著影響（表2），而土壤pH值是調控土壤微生物群落組成和活性的重要環境因子之一[20]。除了土壤pH值，土壤碳源有效性也是調控微生物數量和活性的關鍵因子。我們發現，土壤總PLFA含量和各微生物類群PLFA含量的變化與易分解的有機碳（例如POC）含量變化有顯著正相關關系（表5）。CHENG等[29]在長白山溫帶森林增氮控制試驗的研究也表明，土壤微生物群落的數量顯著受到土壤易分解有機碳含量的調控。盡管施氮沒有對土壤微生物群落數量產生顯著影響，但在無芒雀麥單播草地施氮傾向于降低F/B，而在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地施氮傾向于增加F/B（表3）。以往研究結果表明，施氮對F/B的影響不一，增加[22]、降低[20-21]或沒有顯著影響[25]的結果均有報道。通常認為，土壤細菌群落對施氮的響應比真菌敏感，因為相比于真菌，細菌屬于“富營養型”，具有更高的碳源和養分的需求[17]，因此土壤氮素有效性增加時，細菌的生長速率往往高于真菌，從而導致F/B降低。而F/B在苜蓿單播和苜蓿-無芒雀麥混播草地傾向于增加，表明在混播草地豆科植物（苜蓿）在土壤微生物類群對氮的響應上起著主導作用，其作用機理需要進一步研究。

圖3 水氮處理下顆粒態有機碳含量與土壤酶化學計量比相對變化量（Δ）的關系

除了施氮，本研究中旱季補水也沒有對人工草地土壤微生物群落數量和組成產生顯著影響（表3）。以往許多在草地生態系統的研究也報道了類似的結果[23,30-31]。這個結果的產生可能是經過3年的旱期補水，土壤微生物對水分增加產生了適應性[32]。另外，在苜蓿-無芒雀麥混播模式下，水氮同時添加時土壤總PLFA和細菌PLFA含量均比單獨施氮顯著降低（表3），這可能是由于旱期補水加劇了植物和微生物的氮素競爭而導致的。研究表明，水分是半干旱地區植物生長的關鍵限制因子之一，水分增加對植物地上部和地下部生物量有明顯促進作用[33]。植物根系對養分元素的吸收有擴散、截獲、主動吸收等多種方式，而土壤微生物尤其是細菌則主要靠土壤溶液的擴散作用，因而在土壤氮素有效性提高的情況下，植物相對于微生物對氮素吸收更有競爭優勢，從而可能是導致土壤微生物尤其是細菌數量下降的原因。

相比于微生物PLFA含量，土壤酶活性在不同水氮處理下有顯著差異（圖2）。以往研究認為，增氮會導致與碳周轉相關的水解酶活性增加[21,34]。與這些研究結果類似，本研究中單施氮（N）或補水后施氮（N+W）處理均增加了βG和CB活性，但是N+W處理顯著降低了苜蓿單播土壤的βG和CB的活性。對于氮轉化相關酶，施氮（N處理）顯著降低了苜蓿單播草地土壤中的NAG活性，但是顯著提高了無芒雀麥單播草地土壤的NAG活性（圖2）。目前對氮轉化相關酶對氮素富集的響應不一，促進[35]和抑制[36]的結果均有報道。本研究中，NAG對氮素富集的不同響應可能與牧草類型以及植物、微生物對氮素的競爭有關。豆科植物通常具有固氮能力，因此對外源氮素添加的響應很可能不如禾本科植物敏感。在無芒雀麥單播草地，施氮后植物在氮素吸收競爭中占據優勢，從而導致微生物生長代謝受到氮素限制，因而NAG的活性增加；而在苜蓿單播草地，施氮能夠同時滿足植物和微生物的氮素需求，因此從酶經濟學的角度微生物不需要耗費更多能量來分泌獲取氮素的酶[37]。相比于施氮，補水對土壤酶活性的影響基本為抑制作用或者無顯著影響，除了在苜蓿-無芒雀麥混播草地補水顯著提高了CB的活性（圖2）。這個結果與以往許多研究相吻合[25,35]。此外，除了NAG，其他跟土壤氮素周轉相關的胞外酶（例如蛋白酶和脲酶）也表現出隨水分增加而活性下降[38-39]。

經過3年的水氮處理，盡管人工草地SOC總量沒有顯著變化，SOC的顆粒組成（POC以及MAOC）對施氮產生了顯著的差異性響應（圖1）。在苜蓿單種和苜蓿-雀麥混播模式下，施氮（N處理）促進了POC（粗顆粒有機碳或細顆粒有機碳）的積累。這一結果與SILVEIRA等[40]在放牧草場和CHENG等[29]在溫帶森林的研究結果一致。施氮導致的POC的變化與土壤酶活性以及酶化學計量比的變化密切相關：POC（coarse POC或fine POC）的相對變化量與βG（或CB）活性、βG/NAG（CB/NAG）、βG/AP（CB/AP）的相對變化量均有負相關關系（表5，圖3）。土壤βG（或CB）、NAG、AP活性之間比值能夠反映出土壤微生物對碳、氮、磷養分需求的差異[26]。這一結果說明，土壤微生物對不同養分需求的差異是調控POC周轉的重要驅動力：當微生物生長代謝受到氮（磷）限制時，微生物會增加獲取氮（磷）的投入，從而表現出氮（磷）轉化相關酶活性相對于碳轉化酶活性增加（即酶C/N或C/P比降低），導致活性有機碳（例如POC）的累積；而當碳是微生物群落的主要限制因子時，微生物會相應地增加獲取碳的投入，表現為碳轉化相關酶活性相對于氮（磷）轉化酶活性的增加（即酶C/N或C/P比增加），導致活性有機碳消耗。與POC的變化相反，施氮導致MAOC含量顯著降低（圖1），而ZAK等[13]的研究則發現施氮促進了MAOC的積累。LIANG等[14]的研究發現長期施氮能夠降低土壤微生物殘體生物量（氨基糖），而微生物殘體生物量對于MAOC含量有重要影響[16]。本研究中施氮條件下MAOC的降低是否是由于土壤微生物殘體生物量變化導致的，還需要深入研究。相比于POC，有機碳和礦物顆粒之間的相互作用使得MAOC更加穩定（即惰性有機碳），并且對SOC固持更為重要[8]。因此，施氮導致的MAOC減少可能會導致SOC穩定性下降，不利于人工草地土壤碳的長期固持。此外，施氮對SOC穩定性的負面效應在苜蓿單播草地土壤最為明顯（無論補水還是不補水），而苜蓿-無芒雀麥混播草地旱季補水能夠緩解這種負面影響（圖1）。以往研究表明，不同植物功能群（例如豆科和禾本科）在地下的生態位互補和互惠作用有助于促進土壤微生物活性、提高生態系統對外界環境變化的穩定性[41-42]。因此，相比于單播模式，苜蓿-無芒雀麥混播的種植方式可能提升人工草地土壤碳固持以及生態系統穩定性，對人工草地高效、優質化管理有重要意義。

4 結論

在呼倫貝爾人工草地，3年的施氮和補水對土壤有機碳含量和土壤微生物群落數量未產生顯著影響，但是顯著影響了與碳、氮、磷周轉相關的土壤酶活性、酶化學計量比以及不同SOC組分。施氮對土壤酶活性的影響相對復雜，并且在不同牧草種植模式下有明顯區別，而補水則總體上降低土壤酶活性。施氮能夠促進活性有機碳組分（coarse POC或fine POC）的積累，降低惰性有機碳組分（MAOC）的數量，不利于土壤有機碳庫的穩定性。在苜蓿單種模式下各SOC組分對施氮的響應最為敏感，而苜蓿-雀麥混播在旱季補水條件下有助于緩解施氮對SOC穩定性的負面效應。不同水氮處理下POC含量的相對變化與土壤酶C/N比（或C/P比）有顯著負相關關系，說明土壤微生物對不同養分需求的差異是調控活性有機碳組分周轉的重要驅動力。

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Responses of Soil Organic Carbon Fractionation and Microbial Community to Nitrogen and Water Addition in Artificial Grassland

XU Meng1, XU LiJun2, CHENG ShuLan3, FANG HuaJun1,3, LU MingZhu1, YU GuangXia3, YANG Yan1, GENG Jing1, CAO ZiCheng3, LI YuNa3

(1Key Laboratory of Ecosystem Network Observation and Modeling, Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101;2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Hulunber Grassland Ecosystem Observation and Research Station, Beijing 100081;3College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049)

【】Establishment of artificial grassland provides one solution for releasing some of the grazing pressure on natural grassland, and thus is conducive to the restoration of degraded grassland. The present study aimed to investigate the effects of nitrogen (N) addition and water supplement on soil organic carbon (SOC) fractionation, composition and activity of soil microbial community on artificial grassland established in Hulunber region, so as to provide insight into the effect of management practices on SOC sequestration and stability of artificial grassland.【】Experimental plots were designed with two factors of N addition (0, and 150kg N·hm-2·a-1) and water addition (0, and 60 mm), and were constructed under three types of artificial grasslands, i.e., alfalfa monoculture, smooth bromegrass monoculture, and the mixed cultivation of alfalfa and smooth bromegrass. Soil samples were collected from experimental plots and SOC of bulk soil was fractionated into different particulate-size fractions by wet-sieving method. The abundance, composition and activity of soil microbial community were measured by phospholipid fatty acids (PLFA) and extracellular enzyme activity. Then, the effects of N addition and watering treatments on SOC fractions and soil microbial community, and investigated the relationship between these two components were analyzed.【】Three years of N fertilization and water addition exerted significant impact on SOC fractionation. Addition of N generally increased the content of particulate organic carbon (POC) in soils of alfalfa monoculture and the mixed cultivation but decreased the content of mineral associated organic carbon (MAOC), while water addition significantly increased the content of coarse POC in soils of smooth bromegrass monoculture. The activities of four soil extracellular enzymes but not the abundance or composition of soil microbial community were significantly affected by N and water addition. Nitrogen application without water addition significantly inhibited the activity of β-N-acetylglucosidase (NAG) in soils of alfalfa monoculture, but promoted that in soils of smooth bromegrass monoculture. The activities of cellobiohydorlase (CB) and NAG were significantly decreased by water addition in soils of two monoculture grasslands. Nitrogen application with water addition significantly inhibited the activities of β-glucosidase (βG), CB and NAG in soils of alfalfa monoculture, but significantly promoted CB activity in soils of the mixed cultivation. The changes in PLFA concentration of total community and specific microbial groups were positively correlated with changes in content of POC, but negatively correlated with MAOC. There were negative correlations between the activities of βG and CB, as well as the ratio of enzyme C/N and C/P with changes in POC content, and these correlations were stronger under treatments with water addition.【】Results of the present study showed that in artificial grassland established in semi-arid Hulunbeier region, the addition of N fertilization significantly promoted the accumulation of labile SOC fraction, but decreased the proportion of recalcitrant fraction, which reduced the stability of soil carbon sequestration. Nitrogen fertilization and water supplement induced significant changes in activity of soil microbial communities, and these changes in enzyme stoichiometric ratios were closely related to changes in SOC fractions. These results implied that the differential demands for C, N and P by microbial communities were crucial in regulating the turnover of labile SOC fraction in artificial grassland.

artificial grassland; nitrogen addition; water addition; soil organic carbon; soil microbial community; extracellular enzyme activity; enzyme stoichiometric ratio; Hulunber

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.13.016

2019-09-13；

2019-12-08

國家重點基礎研究發展計劃（2016YFC0500603，2017YFA0604802，2017YFA0604804，2016YFC0503603）、國家自然科學基金項目（41907036，41977041，31770558，41703081）、中國科學院戰略先導專項（XDA2002040203，XDA23060401）、青海省“高端創新人才千人計劃”

徐夢，Tel：15201029279；E-mail：xumeng@igsnrr.ac.cn。通信作者方華軍，Tel：010-64889040；E-mail：fanghj@igsnrr.ac.cn

（責任編輯 林鑒非，李云霞）