基于分子生態學網絡分析松嫩退化草地土壤微生物群落對施氮的響應

朱瑞芬，劉杰淋，王建麗，韓微波，申忠寶，辛曉平

基于分子生態學網絡分析松嫩退化草地土壤微生物群落對施氮的響應

朱瑞芬1，劉杰淋1，王建麗1，韓微波1，申忠寶1，辛曉平2

（1黑龍江省農業科學院草業研究所，哈爾濱 150086；2中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

【】氮素輸入影響著全球草地生態系統的可持續性，關注施氮對土壤微生物群落的影響及其分子生態網絡，為草地退化修復提供理論依據。以松嫩退化羊草草地為研究對象，通過施氮和未施氮處理，利用高通量測序和隨機矩陣網絡構建理論構建土壤微生物群落分子生態網絡。探討氮素管理對退化羊草草地土壤微生物群落結構及網絡的影響，氮添加條件下微生物網絡結構中的關鍵微生物變化規律，以及該過程中微生物之間的互作關系，解析外源氮素添加條件下土壤細菌動態變化的關鍵結點和規律。在門分類水平上施氮處理草地有細菌門22個，未施氮處理23個。7個菌門是施氮和未施氮處理草地的優勢菌門，其中變形菌門（Proteobacteria）是含有OTU數量最多的門類，約占總序列的30.46%，酸桿菌門（Acidobacteria）是含有OTU數量次之的門類，約占總序列的30.15%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）是含有OTU數量第3的門類，約占總序列的8.14%，放線菌（Actinomycete）約占總序列的6.15%，綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）三者約占總序列的17.16%。施氮處理草地土壤微生物中的變形菌門、放線菌門、擬桿菌門的相對豐度均顯著高于未施氮處理草地土壤（＜0.01）；未施氮草地土壤中綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門相對豐度顯著高于施氮草地土壤（＜0.01），其他各門細菌施氮與未施氮處理間未呈現出顯著差異。表征網絡的正向連接比、平均路徑長度、平均聚類系數和模塊性均為施氮處理顯著低于未施氮處理（＜0.001）。在土壤的分子生態網絡中，未施氮處理有16個模塊樞紐（＞2.5，≤0.62），施氮處理有6個模塊樞紐，均屬于酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門。施氮導致土壤微生物種間關系改變，進而改變土壤整體生態網絡。施氮降低了退化草地土壤網絡結構的復雜程度和緊密性；降低了退化草地土壤中的酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度，提高了變形菌門、放線菌門和芽單胞菌門相對豐度。土壤中微生物關鍵物種（OTU）由16個（未施氮）減少為6個，且二者土壤中均沒有重疊OTU，這表明施氮調控微生物群落網絡的關鍵物種，進而改變其分子生態網絡結構。

施氮；退化草地；土壤微生物；分子生態學網絡

0 引言

【研究意義】氮素是植物生長必需的營養元素，也是天然草地生態系統生產力的限制因子。氮素的大量輸入（自然氮沉降和人為施氮）會對草地生態系統可利用氮素狀況造成影響，也會改變土壤生化過程，造成土壤富營養化，還會引起土壤結構與功能的改變，進而導致一系列環境問題[1]。近年來，地下生態過程受到越來越多生態學家的關注。土壤微生物是非常敏感的生命組分，也是草地生態系統的重要組成部分。草地土壤微生物種類和數量，是草地土壤生態的重要特征組成[2]。微生物間的互作是微生物多樣性的重要組成部分，也是影響其群落功能執行的重要因子；分子生態網絡分析（molecular ecological network analysis）是以數學模型為手段分析生態系統中內在相互關系的方法，分子生態網絡分析手段可以很好地體現出生物群落內物種間的互做關系[3-4]。因此，利用分子生態網絡研究施氮土壤微生物種類組成變化以及相互關系，可為深入揭示退化草地土壤的修復機制奠定理論基礎。【前人研究進展】土壤微生物群落作為評估草地生態系統穩定和土壤質量的重要指標[5]，能夠以改變群落結構和功能等方式對環境變化作出響應，而這種響應及其產生的正面或負面的反饋效應可能會對生態系統產生深遠影響。長期以來由于理論和技術的限制，土壤中微生物可培養率只有0.1%—1%[6]，用平板培養法很難得到準確反映微生物變化動態趨勢的數據；研究土壤微生物的非培養方法如磷脂脂肪酸分析、DNA指紋圖譜技術等因工作量大等問題限制其推廣。進入21世紀后，新一代測序技術有了很大發展，基因測序技術具有通量高、測序時間短的優點，且近幾年其成本不斷下降，高通量測序技術已成為科研中探討土壤微生物群落結構和微生物多樣性的重要工具[7]。土壤微生物在養分循環、土壤肥力維持和土壤固碳等關鍵生態過程方面扮演重要角色[8-10]，對草地生態系統穩定性與可持續性有著直接和間接的影響。相關研究結果表明，土壤微生物對氮沉降和土壤理化性質的變化響應十分敏感[11]，氮添加可能通過影響土壤中養分輸入的數量和質量來改變土壤微生物的群落結構[12-13]；氮添加對細菌數量的增加有一定的促進作用，但對真菌數量的影響較小，也有觀點認為氮添加可能會降低真菌的數量[13]。長期施氮降低土壤微生物量，但短期施氮的影響效應具有不確定性。施氮改變了土壤微生物的群落結構組成，對土壤微生物多樣性的影響表現出負效應，但相關研究結果之間差異較大[14]。近年來，有些研究以隨機矩陣原理的生態網絡構建方法（random matrix theory，RMT）為基礎，從相互作用的微生物之間描述和構建出了符合生態網絡的模型[6]，彌補了基于微分方程的網絡方法、貝葉斯網絡方法以及關聯網絡方法[7]對閾值判斷缺乏定量指標的缺陷[15-17]，且利用高通量測序對土壤微生物進行生態網絡分析[18-19]的研究方法為理解復雜的微生物群落的潛在相互作用提供了一種可靠的描繪和認識途徑。【本研究切入點】在草原生態修復和生產力提升過程中，施氮是管理和恢復草原的重要途徑之一。施氮可以增加草原凈初級生產力，增加植被的蓋度和土壤中的有機碳[20]。目前有大量文獻報道了氮添加過程中草地土壤微生物的動態，但這些研究關注點主要是施氮后土壤微生物群落多樣性水平變化、各門類微生物分布特征變化以及與微生物與環境因素的互作這幾方面[1,12-14]，而對施氮后土壤中微生物群落分子生態網絡的影響研究較少；但微生物之間的互作是微生物多樣性的一個重要方面，也極大程度影響著其在生態系統中的作用。因此，從微生物互作網絡的角度解析微生物對施氮的響應是很有必要的。【擬解決的關鍵問題】本研究以松嫩退化羊草草地土壤為研究對象，通過構建氮添加和不添加土壤中的微生物群落分子生態網絡，探討氮素管理對退化羊草草地土壤微生物群落結構及網絡的影響，氮添加條件下微生物網絡結構中的關鍵微生物變化規律，以及過程中微生物之間的互作關系，以期獲得外源氮素添加條件下土壤細菌動態變化的關鍵結點和規律，為退化草原改良提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區自然概況

試驗點位于黑龍江松嫩草原南緣蘭西科學試驗基地（E125°28′24″，Ｎ46°32′17″），該區域年平均降雨量469.7 mm，年均氣溫2.9℃。草原土壤以草甸土為主，偏堿性。植被以羊草為優勢種，五脈山黧豆（）、堿茅（）、牛鞭草（）、寸草苔（）、蘆葦（）等植物為伴生種，詳細描述見文獻[21]。

1.2 試驗設計

試驗利用長期施氮肥試驗平臺（2013年開啟），分別在未施氮肥（F0），施氮肥（F1，3.26 g·m-2·a-1；F2，6.51 g·m-2·a-1；F3，13.032 g·m-2·a-1）處理上調查研究。施氮量、施氮時間、施氮方式、植物性狀和生產力等詳細描述見文獻[21]。由于2015年和2016年的數據分析結果顯示，F3處理對草地產量顯著高于F0處理。因此，本研究僅利用施氮肥（F3）和未施氮肥（F0）處理的試驗數據，構建和分析施氮（F）與未施氮（NF）處理的土壤微生物分子生態網絡。

1.3 樣品采集與測定

采集的土壤經過去除植物殘體和石塊等雜質均分后，一份用于土壤高通量測序，另一份用于土壤化學性質測定[21]，包括全氮（soil total nitrogen content，STN）、全磷（soil total phosphorus content，STP）、速效氮（soil available nitrogen，SAN）、速效磷（soil available phosphorus，SAP）含量。STN、STP用H2SO4-K2SO4-Cu2SO4催化法消解，消煮后的樣品經過濾、稀釋、定容后用AutoAnalyzer3（AA3）連續流動分析儀測定。土壤速效氮含量是指硝態氮（soil nitrate nitrogen，SNO3）和銨態氮（soil ammonium nitrogen，SNH4）的總和，因此對SNO3和SNH4進行分別測定，土壤經過2 mol·L-1KCl浸提、過濾、定容后，用AA3連續流動分析儀測定。SAP采用硫酸鉬梯抗比色法測定。土壤樣品的理化性質見表1。土壤高通量測序由百邁客公司完成，通過統計數據處理各階段樣品序列數目，評估數據質量。

1.4 網絡構建與分析

以土壤細菌高通量測序的結果為基礎，利用美國俄克拉荷馬大學環境基因組學研究所網站（http:// ieg2.ou.edu/MENA）[22]，構建施氮和未施氮處理土壤的微生物分子生態網絡并計算其特征參數。網絡拓撲結構由模塊內連通度（）、模塊間連通度（）來進行表述。衡量一個點在所有模塊中的作用，值越高表明在模塊中的作用越大。衡量一個節點參與其他模塊的程度，值越高表明和其他模塊關系越密切。利用Cytocape軟件繪制網絡圖，比較草地施氮和未施氮條件下土壤微生物網絡的差異，通過對兩者差異的比較來篩選生態網絡中的關鍵微生物物種并分析其在網絡中的主要作用，旨在闡明施氮對退化草地土壤微生物分子生態網絡的影響。

表1 施氮和未施氮處理草地土壤的化學性質

不同小寫字母表示施氮土壤和未施氮處理在＜0.05水平上差異顯著。下同

Different small letters represent significant difference between nitrogenous and non-nitrogenous treatments at＜0.05. The same as below

2 結果

2.1 土壤微生物群落結構的比較

表2對各參數進行統計，利用16SrDNA測序技術測定施氮和未施氮處理草地土壤原核生物序列，在97%相似性水平上分別獲得39 757和43 105個OTUs。在系統分類的門水平上，分別測得的22個和23個細菌門，7個菌門是施氮和未施氮處理草地的優勢菌門（表3）。其中，變形菌門（Proteobacteria）是含有OTU數量最多的門類，約占總序列的30.46%，酸桿菌門（Acidobacteria）是含有OTU數量次之的門類，約占總序列的30.15%，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）是含有OTU數量第3的門類，約占總序列的8.14%，放線菌（Actinomycete）是含有OTU數量第4的門類，約占總序列的6.15%，綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）約占總序列的17.16%。通過比較施氮和未施氮處理草地土壤微生物菌群豐度，施氮處理草地土壤微生物中的變形菌門、放線菌門、擬桿菌門的相對豐度均顯著高于未施氮處理草地土壤（＜0.01）；未施氮處理草地土壤中綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門相對豐度顯著高于施氮處理草地土壤（＜0.01），其他各門細菌施氮與未施氮處理間未呈現出顯著差異。整體水平來說，施氮處理草地土壤細菌群落相對豐度顯著高于未施氮處理草地土壤細菌群落（＜0.01）。

2.2 土壤微生物分子生態網絡拓撲性質的比較

微生物分子生態網絡分析結果表明，以相同相關性閾值（0.90）建立的退化草地土壤的微生物分子生態網絡參數在施氮和未施氮處理下不同（表4），可以看到，未施氮處理下的微生物群落表征網絡平均連通度、平均路徑長度、正向連接比以及平均聚類系數和模塊性顯著高于施氮處理（＜0.001），這些指標間的差異在一定程度說明未施氮處理退化草地的土壤微生物網絡結構較施氮處理具有更高的復雜性和更強的緊密性。

表2 各樣品測序數據評估結果

GC為樣品G和C類型的堿基占總堿基的百分比；Q20為質量值≥20的堿基占總堿基數的百分比；Q30為質量值≥30的堿基占總堿基數的百分比；Effective為有效序列占雙端序列的百分比

GC is the percentage of bases of type G and C in the total bases; Q20 is the percentage of bases with a mass value greater than or equal to 20 in the total bases; Q30 is the mass value bases greater than or equal to 30 accounting for the percentage of total bases; Effective is the percentage of effective tags in double-ended sequences (PE reads)

表3 主要細菌門的OTUs分布

表4 施氮和未施氮退化草地土壤微生物群落的分子生態網絡拓撲性質

*表示＜0.001，代表施氮土壤和未施氮土壤的顯著性差異

*Represents a significant difference between nitrogenous and non-nitrogenous soils at＜0.001

2.3 土壤微生物分子生態網絡拓撲結構

計算未施氮和施氮處理草地土壤的微生物分子生態網絡的模塊間連通度（）和模塊內連通度（）（圖1），結果表明，4類網絡節點中，施氮和未施氮處理土壤微生物的大部分節點屬于外圍節點（peripherals）（≤2.5，≤0.62），節點分布在模塊內部的連接數居多。施氮和未施氮處理土壤微生物的物種節點分布之間均沒有連接器（connectors）（≤2.5，＞0.62）和網絡樞紐（network hubs）（＞2.5，＞0.62），表明物種節點分布之間沒有與一些模塊高度相連，也沒有既是模塊樞紐又是連接器的物種節點，該結果在本研究中的解釋為未施氮處理退化草地土壤微生物和施氮處理草地土壤微生物中幾乎沒有模塊樞紐節點與連接器節點重疊。施氮和未施氮處理土壤微生物節點分布在模塊樞紐（module hubs）（＞2.5，≤0.62）上表現出其模塊內部與許多節點高度連接，未施氮處理土壤的分子生態網絡中有16個模塊樞紐，屬于酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門。施氮處理土壤分子生態網絡結構中有6個模塊樞紐，屬于酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門（表5）。

圖1 基于拓撲結構的施氮和未施氮退化草地土壤微生物分布

2.4 土壤微生物主要菌的相關性

本研究基于python繪制共表達分析表明，圖2—3展示的相關性最高的前50個屬不同。在施氮處理土壤微生物主要菌屬的相互作用網絡中，相對豐度高的有鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、RB41和uncultured_bacterium_c_Subgroup_6，在未施氮處理土壤微生物主要菌屬的相互作用網絡中，相對豐度高的是Blastocatellaceae_[Subgroup_4]、f_Alcaligenaceae、Ferruginibacter和c_S0134_terrestrial- group。圖2—3可知，未施氮處理的土壤微生物主要菌屬的相互關系顯著強于施氮處理，且正相關（橙色）數量在未施氮土壤中顯著多于施氮土壤。同時，施氮處理土壤的關鍵微生物與未施氮土壤中不同。

3 討論

3.1 微生物網絡結構的改變

通過比較施氮和未施氮處理草地土壤微生物菌群豐度，施氮處理草地土壤微生物中的變形菌門、放線菌門、擬桿菌門的相對豐度均顯著高于未施氮處理（＜0.01）；未施氮處理草地土壤中酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門相對豐度顯著高于施氮處理（＜0.01）。整體水平上綜合分析，施氮處理較未施氮處理而言，顯著提高了草地土壤微生物群落相對豐度（＜0.01）。這與之前研究中施加不同含量的氮和氮、磷肥均顯著提高細菌的豐度和多樣性，并顯著改變了細菌群落結構的結論一致[23]。

圓圈代表物種，圓圈大小代表豐度；線條代表兩物種間相關，線的粗細代表相關性的強弱。橙色代表正相關，綠色代表負相關。下同

圖3 未施氮土壤微生物主要菌屬的相互作用網絡

退化草地土壤微生物群落的網絡表明，施氮處理土壤微生物的網絡屬性的正向連接比、平均路徑長度、平均聚類系數和模塊性顯著低于未施氮處理（＜0.001），表明未施氮處理退化草地的土壤微生物網絡結構更加復雜和緊密。施氮處理使微生物之間的互作水平降低，進而可能會影響網絡結構的復雜程度；這表明施氮不僅會改變微生物的群落結構，也可能會改變整體的微生物間的相互作用[24]。

表5 不同處理中關鍵OTUs

3.2 關鍵物種的確定及其相關性

網絡分析方法已經被廣泛應用于各種環境中微生物群落的研究，分子生態網絡分析是通過確定整個網絡中的具有高連接度的物種或物種在模塊內所處的位置，得到整個網絡中的關鍵物種以及一些較為重要的物種。這一類物種可能對微生物群落的結構和功能有著一定的決定作用。土壤微生物物種數極多且數量巨大，其中可培養微生物只占極少部分。影響土壤微生物的因素極其復雜，常規的研究方法很難確定一個群落的關鍵物種，但高通量測序與分子生態網絡分析為我們的探索提供了一種新的思路和科學依據[21]。本研究以網絡拓撲結構和它們的模塊組成關系為基礎，探討草地土壤中對整體微生物網絡中起關鍵作用的OTU。未施氮處理土壤中出現16個模塊樞紐OTU，施氮處理土壤分子生態網絡結構中出現6個模塊樞紐，施氮處理土壤微生物中的模塊樞紐OTU比未施氮處理土壤中的少，但施氮與未施氮處理土壤中的關鍵物種對退化草地的微生物群落網絡結構和功能都起著重要的作用。相關性分析表明（圖2—3），施氮處理與未施氮處理土壤中的關鍵微生物不同，說明施氮選擇性地影響了土壤微生物的繁殖和生長，研究結果與塞拉多生態區（熱帶稀樹大草原）土壤微生物多樣性研究結果一致[22]。也有一些研究認為短期施氮不會對土壤細菌群落產生顯著影響[23]。Ling等[24]對內蒙古溫帶草原的長期氮添加試驗研究發現，細菌豐富度和多樣性指數與氮添加水平呈負相關；Yang[25]研究發現植物功能性狀、非生物土壤特性（土壤 pH、無機氮等）共同驅動了土壤細菌多樣性的改變。通過對劉紅梅[26]不同研究結論的梳理以及與筆者研究結果的對比，筆者認為隨著氮素添加量、添加時間以及研究材料的差異，土壤細菌群落組成、群落多樣性、微生物之間的互做作用等響應會有較大差別。

構建分子生態網絡為研究草地退化過程中微生物群落變化動態和極其復雜的互作關系提供了一種新的思路，但研究過程中的環境特性、土壤類型、微生物組成等方面的差異會較大程度影響試驗結果[27]，目前以統計學為基礎的生態網絡推理方法，不能反映真實狀態下微生物生態功能和相互作用，因此該研究方法有一定的局限性。建議構建微宇宙試驗模擬可控條件下物種多樣性-生態系統功能關系，揭示與驗證外界干擾對微生物群落間互作和功能變化更有依據[28-30]。本研究下一步工作將從施氮梯度和產量的角度對土壤微生物網絡深入研究，以期獲得最佳施肥效果下的最優微生物種群結構，并且對優勢菌群與土壤化學因子結合進行深入分析。

4 結論

本研究利用高通量測序和隨機矩陣網絡構建理論以退化草地施氮土壤為對象，解析了外源氮添加對退化草地土壤微生物群落結構和不同物種間互作網絡關系的影響。施氮降低了退化草地土壤網絡結構的復雜程度和緊密性；降低了退化草地土壤中的酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度，提高了變形菌門、放線菌門和芽單胞菌門相對豐度。土壤中微生物關鍵物種（OTU）由16個（未施氮）減少為6個，且二者土壤中均沒有重疊OTU，表明施氮對草地土壤微生物群落網絡的關鍵物種產生影響，進而進一步改變微生物分子生態網絡結構。施氮會降低土壤主要菌屬之間的正負依存關系，因此施氮量的合理控制是修復退化草地土壤微生物群落結構、微生物群落多樣性及微生物間互作關系的關鍵措施。

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Molecular ecological network analyses revealing the effects of nitrogen application on soil microbial community in the degraded grasslands

ZHU RuiFen1, LIU JieLin1, WANG JianLi1, HAN WeiBo1, SHEN ZhongBao1, XIN XiaoPing2

(1Institute of Pratacultural Science, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086;2Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【】Nitrogen input affects the sustainability of the global grassland ecosystem. Paying attention to the soil microbial community and its molecular ecological network can provide a theoretical basis for grassland degradation restoration.【】Taking Songnen degradedgrassland as the research object, the molecular ecological network of soil microbial community was constructed by applying high-throughput sequencing and random matrix network construction with and without nitrogen treatment. To explore the effects of nitrogen management on the soil microbial community structure and network in degradedgrassland, the key microbial changes in the microbial network structure under the condition of nitrogen addition was studied, and the interaction between microorganisms during the process were investigated, and the conditions for external nitrogen addition key points and regularity of soil bacterial dynamic change were analyzed. 【】At the level of phylum classification, there were 22 bacterial phylum in nitrogen-applied grassland and 23 without nitrogen. The 7 phylum were the dominant phylum of the nitrogen-applied and non-nitrogen-applied grasslands. Among them, Proteobacteria was the phyla containing the largest number of OTUs, accounting for about 30.46% of the total sequence. The next largest genus was about 30.15% of the total sequence. The genus Gemmatimonadetes was the third genus containing OTUs, accounting for 8.14% of the total sequence. Actinomycete accounted for about the total 6.15% of the sequence, while Chloroflexi, Bacteroidetes and Nitrospirae accounted for 17.16% of the total sequence. The relative abundances of Proteobacteria, Actinomycota and Bacteroides in soil microorganisms in nitrogen-applied grassland were significantly higher than those in non-nitrogen applied grassland soil; the relative abundances of Proteobacteria, Actinomycete and Bacteroidetes were significantly higher than the soils of nitrogen-applied grassland (＜0.01), and no significant difference was found between the nitrogen application and non-nitrogen treatment of other bacteria. The forward connection ratio, the average path length, the average clustering coefficient, and the modularity of the characterizing network were all significantly lower than the nitrogen-free treatment (＜0.001). In the molecular ecological network of soil, there were 16 modular hubs without nitrogen treatment (＞2.5,≤0.62), and there were 6 modular hubs under nitrogen treatment, all of which belong to Acidobacteria, Gemmatimonadetes and Actinomycete. Nitrogen application led to changes in soil microbial species relationships, which in turn changed the overall soil ecological network. 【】Nitrogen application reduced the complexity and tightness of soil network structure of degraded grassland, and reduced the relative abundance of AcidobacteriaandChloroflexi in degraded grassland, while which improved the relative abundance of Proteobacteria, Actinomycete and Gemmatimonadetes. The number of microbial key species (OTU) in soil decreased from 16 (no nitrogen application) to 6 and there was no overlapping OTU in both soils, indicating that nitrogen application regulated key species of its community network and thus changes its molecular ecological network.

nitrogen application; degraded grassland; soil microbe; molecular ecology network

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.13.012

2019-09-10；

2020-02-19

國家重點研發計劃（2016YFC0500607-2）、黑龍江省自然科學基金（YQ2019C019）

朱瑞芬，E-mail：zhuruifen1983@aliyun.com。通信作者辛曉平，E-mail：cyszps@163.com

（責任編輯 林鑒非，楊鑫浩）