小麥TaAAC基因克隆及功能的初步驗證

高宏歡，劉素君，姚永偉，馮健超，杜晨陽，謝迎新，王晨陽，盧紅芳，馬冬云

(河南農業(yè)大學農學院/國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450046)

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，提供人體必須的碳水化合物、蛋白質及礦質營養(yǎng)元素等。隨著耕地面積的逐漸減少，增加產量是世界小麥生產的首要目標[1]。小麥粒重的高低受籽粒大小、灌漿充實度等因素影響[2]。在小麥籽粒內容物中，淀粉占總量的70%以上，增加淀粉合成可以有效地提高千粒重和產量[3-4]。小麥籽粒中與淀粉合成有關的多種酶和轉運蛋白[5-6]影響淀粉的合成和直、支鏈淀粉的含量，進而影響淀粉粒的結構和淀粉理化特性。在淀粉合成途徑中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)和腺苷三磷酸(ATP)反應生成ADP-葡萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)，其中產物ADPG是直鏈淀粉、支鏈淀粉和植物糖原的生物合成原料[7]。AGPase是作物淀粉合成的關鍵酶，其活性高低顯著影響淀粉含量[8-9]。小麥中AGPase分為胞質型和質體型，其中質體型為主要的存在形式[10-11]，對籽粒后期淀粉合成發(fā)揮重要作用[8]。研究表明過表達小麥AGPase的質體型小亞基基因TaAGPS1可以顯著提高籽粒內AGPase酶活性和籽粒千粒重[12]。

ATP是生物體內主要的能源載體，而ATP跨膜轉運是生物體能量運輸?shù)闹匾绞?。ATP/ADP轉運蛋白有兩大類，一類是位于線粒體內膜，另一類是位于質體膜。質體膜的ATP/ADP轉運蛋白存在于所有高等和低等植物中[13]，是一種普遍存在于質體膜上的轉運載體，它能夠介導細胞質中高濃度的ATP轉運到質體腔內，同時專一地與質體腔內等量的ADP分子結合并轉移到膜外釋放[14]。因此，質體ATP的轉運對ADPG形成和淀粉合成是必不可少的[15]。線粒體膜上的ATP/ADP轉運蛋白將線粒體中ATP轉運到細胞質，水解成為生物體直接利用的能量，同時細胞質中的ADP轉運到線粒體中進行ATP再生[16]。質體與線粒體的ATP/ADP轉運蛋白共同作用，維持著線粒體、質體以及細胞質三個腔中ATP濃度的平衡，為質體內的同化代謝提供能量[17]。下調表達ATP/ADP轉運蛋白基因，則導致馬鈴薯塊莖中淀粉的含量下降[18]。于林卉等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達ATP/ADP轉運蛋白基因，在玉米籽粒灌漿中期胚和胚乳中的表達量急劇升高。關于小麥淀粉合成的研究多集中在淀粉合成途徑中相關功能基因的驗證中，而小麥淀粉合成過程中與能量代謝重要相關的ATP/ADP轉運蛋白基因研究較少。

本研究以小麥品種百農207為材料，克隆小麥ATP/ADP Carrier基因(TaAAC)，并以小麥GFP基因為對照，構建BSMV-VIGS-TaAAC重組表達載體，接種小麥幼穗，進一步通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術，檢測在小麥籽粒發(fā)育期間TaAAC基因的表達量，以初步明確小麥TaAAC基因在籽粒淀粉合成過程中的作用，并為通過轉基因或分子標記輔助選擇來改善小麥品質、提高粒重和產量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為普通小麥品種百農207，由河南百農種業(yè)有限公司和河南華冠種業(yè)有限公司用周16/百農64選育而成，于2018年10月15日播種于河南農業(yè)大學科教示范園區(qū)，基本苗為210×104株·hm-2，管理模式同當?shù)爻Ｒ?guī)高產麥田。BSMV重組病毒載體α、β、γ和γ-GFP由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1TaAAC基因的克隆

根據(jù)我們前期蛋白質組學的分析結果[20]，以差異蛋白ATP/ADP轉運蛋白(UniProt登錄號:M8A2G0)為參考序列在國際小麥基因組測序聯(lián)盟數(shù)據(jù)(IWGSC,http://www.wheatgenome.org/)進行Blast，獲得小麥TaAAC的cDNA(TraesCS6A02G282200.1)序列，以該序列為模板設計引物AACCDS-F:5′-AGATGGCGGACC GTGCTAA-3′和AACCDS-R:5′-TCATCATTT CCCCTCTAGGC-3′，并克隆基因的全長。擴增體系為：PrimeSTAR Max Premix(2 x)25 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μM)1 μL，Reverse Primer(10 μM)1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 21 μL。PCR擴增程序為：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min,最后維持4 ℃保存。本研究涉及的引物和測序服務均由河南尚亞生物技術有限公司完成。膠回收試劑盒和ZT4-Blunt載體由北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供。

1.2.2TaAAC基因的生物信息學分析

利用DNAMAN軟件分析TaAAC基因的測序結果，利用Pfam(https://pfam.xfam.org/search)對小麥TaAAC蛋白進行結構域分析。利用ProtComp 9.0(https://linux1.softberry.com/berry.phtml)對小麥TaAAC蛋白進行亞細胞定位分析。通過在線分析工具ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測TaAAC蛋白的基本理化性質。利用在線預測軟件NPS-SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預測TaAAC蛋白的二級結構。利用ExPASy-SWISS MODE(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測TaAAC蛋白的三級結構。利用NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.n1m.nih.gov/Blast.cgi)對所克隆基因進行相似性比對和同源性分析，將比對結果輸入MEGA 5.05，采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹，其中，bootstrap值設置為1 000，其余均為默認參數(shù)。

1.2.3 BSMV-VIGS-TaAAC載體的構建

根據(jù)TaAAC的CDS序列，利用Primer Primer 5.0設計引物擴增基因的沉默片段，引物序列為 AAC-F:5′-CCAGAACCAGGATGAGATG-3′和AAC-R:5′-CGAACCACTTCCAGTAACC-3′。用NheⅠ 限制性內切酶酶切γ載體和沉默片段，將酶切完全的γ載體和沉默片段進行連接；用MluⅠ 限制性內切酶酶切α、γ-GFP和γ-AAC載體，SpeⅠ 酶切β載體，線性化酶切產物并回收純化。限制性內切酶NheⅠ、MluⅠ、SpeⅠ以及PCR產物純化試劑盒均購自TaKaRa公司。Large Scale RNA Production Syetems-T7(Promega，美國)和Ribo m7U Cap Analog(Promega，美國)對線性化產物進行體外轉錄。

1.2.4TaAAC基因功能驗證

在小麥抽穗期，選擇長勢良好、且大小一致的麥穗進行標記接種。將α、β、γ-GFP和γ-AAC體外轉錄產物各取2.5 μL，按1∶1∶1比例混合，用等體積的DEPC水混合，加入270 μL的FES緩沖液，混勻后置于冰上保存。接種時佩戴無酶橡膠手套，用無酶槍頭吸取10 μL混合液點在食指上，左手固定麥穗，右手大拇指和食指輕輕來回摩擦麥穗，分別接種100穗。接種后噴灑少許DEPC水，封口膜覆蓋保濕24 h。在接種后定期觀察穗部變化并取樣。

根據(jù)TaAAC基因cDNA序列設計qRT-PCR引物qRTAAC-F:5′-GGGTGGAGGTGACAGGCAAT-3′和qRTAAC-R:5′-AAGAGCAAAGCTGGCAAAGAA-3′。qTaActin-F:5′-CCTCTCTTAGCACTTTCCAGCA-3′和qTaActin-R:5′-GTAAGTCCCCTTCACCGACTC-3′。分別在接種后14、19、24和29 d進行取樣，-80 ℃保存。在QuantStudio 5 Real-Time PCR System(Themo Fisher,BIO INC,CA,USA)上進行qRT-PCR分析，反應體系與程序參考TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ(TaKaRa，大連)試劑盒說明書，試驗設置3個生物學重復和3個技術重復，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。qRT-PCR反應體系為：TB Green premix EX Taq Ⅱ(2 x)10μL，F(xiàn)orward Primer(10 μM)1 μL，Reverse Primer(10 μM)1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR反應程序為：預變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40個循環(huán)； 溶解曲線分析：95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.2.5 淀粉含量測定

采用Kang等[10]的方法測定總淀粉含量，參考何照范等[21]的方法測定直鏈淀粉含量，總淀粉減去直鏈淀粉得出支鏈淀粉含量。每個樣品測定3次，求平均作為樣本均值。

2 結果與分析

2.1 TaAAC基因序列特征

以百農207 cDNA為模板，克隆該基因的CDS序列，電泳檢測結果如圖所示(圖1)，將PCR產物進行膠回收，連接至ZT4-Blunt載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，對應菌液測序，測序結果顯示TaAAC基因，大小為1 143 bp，與來源于中國春的ACC基因序列進行比對，兩者之間的DNA序列完全一致(圖2)。

M:Marker 2000; 1:以百農207 cDNA為模板擴增TaAAC基因CDS序列。

2.2 TaAAC基因生物信息學分析

TaAAC基因CDS區(qū)域長度為1 143 bp，編碼380個氨基酸。利用Pfam分析表明，TaAAC蛋白存在三個線粒體載體結構域(圖2劃虛線部分)。利用ProtComp 9.0預測結果表明，小麥TaAAC 蛋白可能定位于線粒體、內質網(wǎng)和質膜三個部位，得分分別為5.85、2.56和1.34。利用ExPASy-ProtParam分析表明，氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)為28.30，小于40，為穩(wěn)定蛋白質。平均親水性系數(shù)為負值，為親水蛋白質。利用SOPMA進行二級結構預測，發(fā)現(xiàn)TaAAC蛋白二級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲4種成分組成。α-螺旋(43.95%)和無規(guī)則卷曲(37.89%)為主要成分，延伸鏈(12.63%)和β轉角(5.53%)所占比例相對較少。利用SWISS-MODEL進行三級結構預測(圖略)，結果與二級結構相一致，α-螺旋和無規(guī)則卷曲仍是主要的結構原件。

實線下劃線表示沉默片段，虛線下劃線表示TaAAC蛋白的線粒體載體結構域對應片段。

2.3 TaAAC基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 5.05對TaAAC蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)ATP/ADP轉運蛋白可以分為兩類，一類是位于質體膜蛋白，另一類是位于線粒體膜蛋白。從圖3可以看出，本研究中TaAAC蛋白與線粒體膜蛋白親緣關系較近，與質體膜蛋白親緣關系較遠。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，TaAAC蛋白與水稻(Oryzasativa，XP 015625645.1)的一致性為92.17%，與高粱(Sorghumbicolor)的一致性為89.46%，與粟(Setariaitalica)的一致性為88.95%。

不同物種的蛋白質ID號和括號中的蛋白定位信息均來自NCBI上的注釋信息，進化樹中分枝前的數(shù)字代表親緣關系，分數(shù)越大，親緣關系越近。

2.4 TaAAC基因的功能

本研究采用引物AAC-F和AAC-R，擴增出TaAAC基因CDS中長度為233 bp(圖4A)的沉默序列片段(具體序列見圖2中劃實線部分)，將此沉默目的片段和γ載體利用NheⅠ限制性內切酶進行酶切并連接，成功構建BSMV-VIGS-TaAAC沉默載體。對α、β、γ-GFP和γ-AAC載體，酶切后線性化產物，并回收純化(圖4 B)。

M1:Marker 2000; 1:擴增片段。M2:Marker 10000; 2～5:α、β、γ-GFP和γ-TaAAC。

小麥抽穗期，選取長勢良好且大小一致的百農207麥穗，分別在穗部摩擦接種BSMV-VIGS-TaAAC和 BSMV-VIGS-GFP，各接種100穗。在接種后15 d，接種BSMV-VIGS-TaAAC的麥穗表現(xiàn)出大麥條紋花葉病毒黃斑癥狀，接種后 25 d黃斑癥狀蔓延至整穗(圖5)。分別在接種后 14 d、19 d、24 d和29 d取樣，采用qRT-PCR方法，檢測了TaAAC在籽粒中的轉錄水平(表1)。結果表明，與接種BSMV-VIGS-GFP的對照植株籽粒相比，接種BSMV-VIGS-TaAAC的籽粒中TaAAC的表達量顯著下降，在接種后第 24 d和第29 dTaAAC基因表達量分別下降了51%和67%，表明成功獲得了TaAAC基因沉默的小麥植株。

表1 接種BSMV-VIGS-GFP和BSMV-VIGS-TaAAC后不同時期小麥籽粒中TaAAC的轉錄水平

A:BSMV-VIGS-TaAAC; B:BSMV-VIGS-GFP.

成熟期分別收獲接種BSMV-VIGS-TaAAC和BSMV-VIGS-GFP的籽粒(圖6)，測定千粒重、總淀粉含量、直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量(表2)。與接種BSMV-VIGS-GFP的對照植株相比，接種BSMV-VIGS-TaAAC的籽粒中直鏈淀粉含量下降了7.78%，支鏈淀粉含量下降了24.61%，千粒重下降了12.44%，總淀粉含量下降了 19.87%。統(tǒng)計分析結果表明，千粒重和總淀粉含量與對照的差異均達到顯著水平。這些結果表明TaAAC基因可能參與了調控小麥籽粒淀粉的合成，進而影響了粒重。

A:BSMV-VIGS-GFP; B:BSMV-VIGS-TaAAC.

表2 誘導TaAAC基因沉默植株及對照的千粒重、總淀粉含量、直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量的差異

3 討 論

ATP為生物體內許多的生理生化反應提供大量的能量，維持整個機體正常運轉。線粒體為植物生長代謝提供了主要的能量來源,位于線粒體內膜的ATP/ADP轉運蛋白，運輸線粒體內ATP與細胞質中的ADP正常交換，連接ATP的生成和輸出[22]。除了線粒體中的ATP/ADP轉運系統(tǒng)，在質體上也存在著同樣的轉運機制[23]。通過質體ATP/ADP轉運蛋白將細胞質的ATP轉運到質體腔內,為質體內淀粉和脂肪酸的合成提供能量[24]。本研究通過對TaAAC蛋白的亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能定位于線粒體膜和質體膜上；系統(tǒng)進化樹分析結果表明，ATP/ADP轉運蛋白包括質體膜蛋白和線粒體膜蛋白，與TaAAC蛋白質亞細胞定位結果相符合，但與線粒體膜蛋白的親緣關系更近。關于TaAAC蛋白的亞細胞定位還有待于進一步通過構建表達載體來確定。

BSMV-VIGS是進行基因功能驗證的一個方便和有效的技術手段，Bennypaul等[25]利用BSMV-VIGS技術沉默GBSS基因，導致小麥籽粒中直鏈淀粉的含量下降了30%～40%；呂亮杰等[26]應用BSMV-VIGS技術沉默負向調控小麥淀粉的合成的WSR1基因，導致籽粒內支鏈淀粉和總淀粉含量顯著增加。因此，采用BSMV-VIGS技術研究TaAAC功能完全可行。同時，本課題組經(jīng)過多年的田間試驗，在接種期間，在接種區(qū)域植株上方搭建臨時控溫棚，以保持該區(qū)域的溫度和濕度，增加接種效率。由于小麥是異源六倍體，TaAAC在6A、6B和6D上的同源性高達99.29%。因此，本研究中沉默的TaAAC的表達量的可能來自于3個拷貝。關于不同染色體上TaAAC表達量的高低，以及對淀粉合成的作用有待進一步通過基因編輯獲得不同突變體植株進行研究。

研究表明，質體ATP/ADP轉運蛋白對淀粉合成和粒重高低有顯著調控作用[14,19]。同時ATP/ADP轉運蛋白可以介導細胞質中的ATP為AGPase 合成ADP-葡萄糖(ADPG)提供能量[23]，調控這一個限速步驟中的能量來源，可以改變淀粉的合成速率和結構。本研究利用BSMV-VIGS技術，在成功沉默TaAAC基因的植株中籽粒淀粉含量和千粒重顯著下降，表明TaAAC基因影響了ATP/ADP的轉運,從而影響了小麥籽粒淀粉合成的過程。由于AGPase存在胞質型和質體型兩種形式，且兩種存在形式的基因表達量高低均對淀粉合成和籽粒粒重有顯著影響[10,12]，本研究中TaAAC可能存在于線粒體和質體，關于TaAAC調控淀粉合成的機制有待進一步的探究。