蝴蝶蘭PhNAC1基因序列分析及對低溫脅迫的響應

梁芳 張燕 牛蘇燕 袁秀云 崔波

摘 要： 為探討NAC轉錄因子在蝴蝶蘭低溫脅迫響應中的分子調控機理，該研究以蝴蝶蘭的葉片為材料，運用RT-PCR及RACE技術克隆得到一條蝴蝶蘭的NAC轉錄因子基因完整的cDNA序列，命名為PhNAC1（GenBank登錄號MF797909），并分析了其在兩種低溫條件下的表達模式。結果表明：PhNAC1基因cDNA序列全長1 442 bp，ORF全長942 bp，編碼313個氨基酸。預測其蛋白分子量為35.22 kDa，等電點為6.95，屬于穩定親水性蛋白。二級結構預測表明，無規則卷曲和延伸鏈為該蛋白的主要結構元件，與三級結構預測結果基本相符。PhNAC1編碼的氨基酸序列與其他已登錄的蘭科植物NAC蛋白進行同源序列比對，表明與小蘭嶼蝴蝶蘭（XP_0205763790）親緣關系較近，序列一致性達97%，其次為鐵皮石斛（XP_020695081），一致性為84%。實時熒光定量PCR分析表明，PhNAC1基因在營養器官和生殖器官中均有表達，在蕊柱中的表達量最高。在11 ℃/6 ℃低溫條件下，PhNAC1基因的轉錄表達水平在前5天隨著處理時間逐漸升高，到第7天開始下降;在4 ℃低溫條件下，PhNAC1基因的表達水平在處理0.5 h時表達量有所下降，1 h后表達量上升至對照水平，之后無明顯變化，在處理24至48 h又逐漸升高，推測PhNAC1基因參與蝴蝶蘭低溫脅迫響應。

關鍵詞： 蝴蝶蘭， NAC轉錄因子， 表達特性， 低溫脅迫， 序列分析

中圖分類號： Q785;Q786 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）06-0845-09

開放科學（資源服務）標識碼（OSID） ：

Abstract： NAC transcription factors are involved in many processes of plant development， which play an important role in stress response. The NAC transcription factor named PhNAC1 （GenBank accession No. MF797909） was cloned from the leaves of Phalaenopsis using RT-PCR and RACE method. The full-length of PhNAC1 was 1 442 bp， which contained a 942 bp ORF that encoding a protein with 313 amino acids residues. The molecular weight of the putative protein was 35.22 kDa and the theoretical pI was 6.95， a hydrophilic and unstable protein. Prediction of secondary structure showed that the random coil and extended strand were the main structural elements of the protein， which conformed to the prediction of tertiary structure. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis between the protein of PhNAC1 and NACs from other Orchids showed that PhNAC1 was close to Phalaenopsis equestris （XP_020576379） with the sequence identity of 97%， followed by the Dendrobium catenatum （XP_020695081） with 84%. The qRT-PCR analysis indicated that the PhNAC1 gene was expressed in both of the vegetative and reproductive organs， and the expression level was the highest in the column. Under the cold stress of 11 ℃/6 ℃， the expression level of PhNAC1 gene was increased significantly with treatment time in leaves during the first five days， and then decreased at the 7th day. Under the cold stress of 4 ℃， the expression level was decreased slightly at 0.5 h， then recovered and remained to the initial level at 1 h after treatment， whereas the expression level was increased obviously after treating for 24、48 h， indicating that PhNAC1 may be involved in cold stress response of Phalaenopsis. This research will be useful for study of molecular mechanism of NAC transcription factor in cold stress response in Phalaenopsis species.

Key words： Phalaenopsis， NAC transcription factor， expression pattern， cold stress， sequence analysis

基因的轉錄調控控制著植物生長發育的許多重要生理過程，如逆境應答、信號轉導、形態建成等。轉錄因子通過與特異的目的基因啟動子區相結合，激活或抑制目的基因的轉錄效率，從而使植物對外界刺激做出響應。近年來，NAC、MYB、WRKY、AP2/EREBP等轉錄因子在植物逆境中的響應機制被廣泛研究（Scarpecie et al.， 2013;Xue et al.， 2014;Guan et al.， 2014;Butt et al.， 2017）。其中，NAC轉錄因子是目前發現數量最大的植物特有的轉錄因子家族之一（Olsen et al.， 2005）。最早在矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2和CUC2基因編碼蛋白的N端發現一段高度保守的氨基酸序列，以此3個基因的首字母命名為NAC結構域，并將包含NAC結構域的蛋白稱為NAC轉錄因子。NAC轉錄因子的研究多集中在被子植物。通過對擬南芥和水稻的NAC轉錄因子進化分析，NAC結構域可分為兩組18個亞組，NAC結構域高度保守，僅有少數氨基酸差異，在NAC蛋白C端轉錄激活區有13個保守基序（Ooka et al.， 2003）。

NAC轉錄因子參與植物生長發育諸多過程，包括胚的發育（Larsson et al.， 2011;Zhao et al.， 2011）、側根形成（Hao et al.， 2011）、葉片衰老（Jia et al.， 2018）、果實成熟（Kou et al.， 2012）、激素信號傳遞和調控（Wang et al.， 2014）等。此外，NAC轉錄因子在植物逆境應答過程中起著關鍵作用（Shao et al.， 2015）。現已在許多植物中分離到NAC基因證明其能提高植物對低溫脅迫的抗性，如水稻SNAC2（Hu et al.， 2008）、小麥TaNAC8（Xia et al.， 2010）、TaNAC2（Mao et al.， 2012）和TaNAC47（Zhang et al.， 2015）、芒草MlNAC5（Yang et al.， 2015）和MlNAC9（Zhao et al.， 2016）、苜蓿MfNAC3（Qu et al.， 2016）等。雖然與抗逆相關的NAC轉錄因子在擬南芥和水稻中研究較為深入，但在蘭花中的研究還見之甚少，僅見Mita et al.（2006）報道蕙蘭（Cymbidium faberi）CyNAC1轉錄因子參與高溫（25～30 ℃）導致幼嫩花芽的壞死過程，發現在變異的抗高溫植株中，該基因表達量明顯比野生型低。關于蘭科植物在低溫脅迫過程中NAC轉錄因子的相關研究目前尚未見報道。

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）是世界著名的高檔花卉，在我國各地廣泛栽培。原產于熱帶亞熱帶地區，性喜暖畏寒，生長適溫為18～28 ℃，溫度過高或過低均會限制蝴蝶蘭的生長。因此，低溫是影響蝴蝶蘭生長的重要環境因子之一。我國北方地區蝴蝶蘭均在現代化溫室內種植，冬春季節溫度較低時需對溫室進行加溫，因此導致生產成本升高，耗能巨大制約了蝴蝶蘭產業的健康發展。因此，研究蝴蝶蘭抗冷的生理生化機制，培育抗冷性新品種，對于蝴蝶蘭產業的健康可持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

所用材料為蝴蝶蘭栽培品種“大辣椒”（Phalaenopsis hybrid ‘Big Chili），由鄭州師范學院生物工程研究所提供。兩種低溫處理條件：將5葉期的蝴蝶蘭植株置于植物人工光照培養箱（美國，PERCIVAL E-41HO2）內27 ℃/22 ℃預培養15 d，使所有的實驗苗Fv/Fm≥0.79。實驗采用模擬自然狀態逐步降溫法，分為兩個階段，第一階段低溫馴化：晝夜溫度20 ℃/16 ℃處理3 d，16 ℃/11 ℃處理3 d;第二階段11 ℃/6 ℃低溫處理7 d。其他培養條件：光暗比12 h/12 h，光強為60 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%～90%。取樣方法：以27 ℃/22 ℃預培養結束取樣為對照，晝夜溫度11 ℃/6 ℃處理第1、2、3、5、7天取樣。另外4 ℃低溫處理，用蝴蝶蘭3葉期瓶苗，置于4 ℃冰箱內分別于0、0.5、1、2、4、8、12、24和48 h取樣。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 各樣品總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒。對提取的總RNA經檢測合格后，用M-MLV反轉錄酶對其進行反轉錄合成單鏈cDNA第一鏈，用于PhNAC1基因的克隆;用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄成cDNA第一鏈，用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測目的基因表達量。

1.2.2 PhNAC1基因全長的擴增及ORF的預測與驗證 利用DNAMAN和Primer 5.0軟件，以GenBank中已登錄的JF831198（鐵皮石斛， Dendrobium candidum）、KC954544（鐵皮石斛， Dendrobium officinale）和AB257312（蕙蘭， Cymbidium hybrid）為模板，設計1對簡并引物PhNAC1-F和PhNAC1-R（表1），用于擴增蝴蝶蘭NAC基因中間保守片段。將得到的中間保守序列經BLAST比對正確后，分別設計1對5′端特異引物（GSP5-1、GSP5-2）和3′端特異引物（GSP3-1、GSP3-2）。對中間保守區片段、5′-RACE擴增片段和3′-RACE擴增片段進行分析比對并拼接， 通過BLAST對得到的基因全長進行同源性比對，確定得到的基因為NAC基因。在ORF區兩端設計特異引物ORF-F和ORF-R對ORF序列進行驗證。

1.2.3 PhNAC1基因的生物信息學分析 蝴蝶蘭PhNAC1基因蛋白結構域、理化性質、親疏水性、磷酸化位點、以及蛋白質的二級和三級結構等采用在線軟件進行分析。此外，核苷酸與氨基端序列的同源性用DNAMAN軟件進行比對分析，并用Clustal X和MEGA構建系統進化樹。

1.2.4 PhNAC1基因的表達特性分析 取蝴蝶蘭的根、葉（第2片）、花葶、花芽、萼片、翼瓣、唇瓣及蕊柱，迅速投入液氮中速凍后-80 ℃冰箱保存，用于PhNAC1基因在不同組織中的表達分析。低溫脅迫處理均取第2片成熟葉，每個取樣點有三個生物學重復，每個重復由三株不同植株混合而成。

根據得到的ORF序列，設計qRT-PCR引物PhNAC1-qF和PhNAC1-qR，以蝴蝶蘭Actin基因作為內參基因。采用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進行qRT-PCR，反應體系為25 μL，反應條件：95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s（40個循環），反應在Eppendorf Mastercycler熒光定量PCR儀上進行，每個樣品重復3次，同時做陰性對照。基因相對表達量用公式2-ΔΔCt來計算（Vandesompele et al.， 2002）。

2 結果與分析

2.1 PhNAC1基因全長的擴增

以蝴蝶蘭葉片cDNA為模板，以引物PhNAC1-F和PhNAC1-R進行中間片段的擴增，得到約350 bp的保守片段（圖1：A），經BLASTn比對分析表明克隆的片段為NAC基因片段。根據該片段序列，利用引物GSP3-1和GSP3-2進行3′-RACE擴增，得到大小約780 bp目的片段（圖1：B），利用引物GSP5-1和GSP5-2進行5′-RACE擴增，得到大小約320 bp目的片段（圖1：C）。將測序得到的中間保守區片段、5′-RACE擴增片段及3′-RACE擴增片段進行分析拼接，得到全長為1 442 bp的基因序列，其中包括一個完整的長為942 bp ORF，編碼313個氨基酸。對ORF區進行克隆驗證，得到997 bp的片段（圖1：D）， 與全長部分序列完全相M. DL2000 DNA 標記; 1. 中間保守片段; 2. 3′-RACE片段; 3. 5′-RACE片段; 4. 開放閱讀框。

同。經BLAST分析， 所得的核苷酸序列與小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris， XP_020576379）一致性為98%，與小野芭蕉（Musa acuminata）NAC79基因序列一致性為79%，通過比對分析表明克隆的基因為NAC家族基因。將該基因命名為PhNAC1，GenBank登錄號MF797909。

2.2 PhNAC1基因的生物信息學分析

2.2.1 PhNAC1蛋白的基本性質及空間結構分析 通過對PhNAC1基因推導的氨基酸序列進行分析，表明該蛋白屬于植物特有的NAC轉錄因子家族。CDD數據庫分析結果表明，該蛋白第8至第134個氨基酸為NAC結構域。生物信息分析結果表明PhNAC1蛋白屬于親水性蛋白，該蛋白分子質量約為35.22 kDa、理論等電點pI為6.95，分子式為C1563H2375N417O477S18;正負電荷殘基總數均為35。在組成PhNAC1蛋白的20種氨基酸中，Ser所占的比例最高，為10.2%，His和Cys所占比例最低，僅為1.6%。該蛋白脂肪指數56.10，不穩定指數為33.53，屬于穩定蛋白。PhNAC1蛋白序列中存在41個潛在的磷酸化位點，包括21個Ser位點、14個Thr位點和6個Tyr位點。對PhNAC1蛋白進行二級結構預測，結果表明該蛋白二級結構由α螺旋（Hh）、伸展鏈（Ee）和無規則卷曲（Cc）組成，其中無規則卷曲占70.6%，伸展鏈占27.48%，α螺旋僅占1.92%。

采用SWISS-MODEL同源建模的方法，以4dul.1 （擬南芥ANAC019）為模型對PhNAC1進行蛋白質三級結構建模（圖2），結果表明PhNAC1與4dul.1相似性為56.33%，推測PhNAC1是與脅迫響應相關的NAC轉錄因子。

2.2.2 PhNAC1基因同源性與系統進化分析 將蝴蝶蘭PhNAC1基因編碼的氨基酸序列（AXF50252）與已登錄到NCBI上的其他4種蘭科植物的 NAC蛋白進行序列比對分析（圖3），PhNAC1與小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris， XP_020576379）的氨基酸序列一致性最高為97%，均為313個氨基酸，二者僅有8個氨基酸的差異;其次為鐵皮石斛（Dendrobium catenatum， XP_020695081），二者序列一致性為84%;與深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica， PKA66962）和雜交蘭（Cymbidium hybrid， BAF36563）的一致性較低，分別為51%和32%。將PhNAC1氨基酸序列經BLAST比對，選擇序列一致性較高的15種植物，利用NJ法構建無根系統進化樹（圖4），顯示蝴蝶蘭與小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛、深圳擬蘭親緣關系最近，其次為番紅花（Crocus sativus， ABU40776），與其他植物的親緣關系較遠。

2.3 PhNAC1基因的表達特性分析

由圖5可知，PhNAC1基因在蝴蝶蘭的營養器官和生殖器官中均有表達，在蕊柱中的表達水平最高，明顯高于其他組織，在根、葉和翼瓣中表達水平最低。在11 ℃/6 ℃低溫條件下，PhNAC1基因的轉錄表達水平在處理1、2、3、5 d逐漸升高，處理第7天明顯下降（圖6：A）;在4 ℃低溫條件下，PhNAC1基因的表達水平在處理0.5 h表達量下降，處理1 h后表達量上升至對照水平，之后無明顯變化，在處理24 h和48 h后又明顯升高（圖6：B）。

3 討論與結論

NAC轉錄因子是一類數量巨大的植物轉錄因子，在植物的生長發育調控及抗逆響應中發揮重要的作用（Sun et al.， 2018;Singh et al.， 2016）。Liu et al.（2019）報道NAC轉錄因子參與高溫誘導的荔枝花序敗育。Wang et al.（2014）首次報道西瓜NAC轉錄因子CcNAC1和CcNAC2參與光信號途徑和生長激素信號途徑。通過抑制ABA信號通路相關基因，過表達ONAC066可以提高水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性（Liu et al.， 2018）。本文從蝴蝶蘭中通過同源克隆的方法得到一個NAC轉錄因子基因PhNAC1，對該基因編碼的氨基酸序列進行分析，發現在N端具有NAC結構域，該結構域是NAC轉錄因子特有的結構域。運用生物信息學方法對PhNAC1蛋白進行分析預測，PhNAC1是一種穩定的親水性蛋白，具有多個潛在的磷酸化位點。將PhNAC1蛋白與其他已登錄的蘭科植物NAC蛋白序列進行比較，發現都具有高度保守的N端和多變的C端，N端含有A、B、C、D、E 5個典型亞結構域（Puranik et al.， 2012）。進化分析表明，PhNAC1與小蘭嶼蝴蝶蘭的親緣關系最近，僅有8個氨基酸的差異，序列一致性達到97%。三級空間結構預測表明，PhNAC1與擬南芥ANAC019的相似度最高，推測PhNAC1是與脅迫響應相關的NAC轉錄因子（Jenson et al.， 2010）。

用實時熒光定量PCR對PhNAC1基因在蝴蝶蘭各個組織中的表達特性進行了研究，發現PhNAC1基因在蝴蝶蘭的根、葉及各個花器官組織A-E下劃線部分分別代表NAC結構域中5個保守的亞結構域。

中均有表達，其中在蕊柱中的表達量明顯高于其他部位和組織。蝴蝶蘭的蕊柱（Column）是雄蕊和花柱、柱頭完全愈合而成的一種柱狀體，頂端著生一個花粉塊。PhNAC1基因在蕊柱中的高表達機理還有待進一步研究。PhNAC1基因在低溫脅迫條件下的表達分析表明，在11 ℃/6 ℃的晝夜溫度條件下，該基因的表達水平隨著處理時間逐漸升高，到第5天表達量是對照的34倍，第7 天表達量開始下降。在4 ℃低溫條件下，處理0.5 h表達量有所下降，之后開始上升恢復到對照水平維持至12 h，到24 h后表達量又開始上升，由此推測PhNAC1基因在蝴蝶蘭低溫脅迫響應中發揮作用。擬南芥和水稻全基因組表達譜研究表明，一些NAC基因受到高溫、干旱、低溫或病害中的一個或多個因素誘導表達。如擬南芥中的ANAC019、ANAC055、ANAC072（RD26）均對不同非生物脅迫有應答反應（Fujita et al.， 2004;Delessert et al.， 2005;Fang et al.， 2008）;在水稻中，OsNAC6和SNAC2超量表達可以提高幼苗發育階段對干旱、高鹽和低溫的耐受性（Lu et al.， 2007;Nuruzzaman et al.， 2010）。

本研究首次克隆了蝴蝶蘭的NAC基因PhNAC1，分析了其在兩種低溫條件下的表達模式，結果顯示其在低溫脅迫24 h后即開始上調表達，表明蝴蝶蘭PhNAC1轉錄因子能夠對低溫做出積極響應，以及時調節下游冷相關基因的表達，減輕逆境對植物可能造成的傷害。

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（責任編輯 何永艷）