規模化白羽肉種雞場沙門氏菌的分離與鑒定

郭龍宗

摘 ?要：本研究對2013～2016年規模化養殖場雞沙門氏菌感染情況進行了調查研究，并對采集的雛雞、毛蛋、環境等樣品進行了沙門氏菌的分離鑒定，結果顯示：2013～2016年所有采集樣品沙門菌的平均分離率為3.8%，分離菌株以腸炎沙門氏菌為主。

關鍵詞：沙門氏菌;種雞場;分離與鑒定

沙門氏菌（Salmonella）感染可引起禽類各種急性和慢性疾病，這些疾病在許多國家引起了重大的經濟損失。隨著現代家禽商業化養殖規模的擴大，沙門氏菌的傳播更加復雜[1]。目前全球已知的沙門氏菌血清型有近2500種，其中禽類已報道有38種，分屬于6個血清群[2]。許多血清型的沙門氏菌能通過食物鏈傳染給人，從而引起人類的食物中毒，因此沙門氏菌病是具有重要意義的人畜共患病之一，對醫學、獸醫學及公共衛生學均具有十分重要的意義[3]。目前我國常見的致病性沙門氏菌血清型包括腸炎、鼠傷寒、雞白痢和雞傷寒等[4]，不但嚴重影響我國養禽業的健康發展，而且與食品安全問題密切相關。本研究對2013～2016年規模化養殖場雞沙門氏菌感染情況進行了調查研究，并對采集樣品進行了沙門氏菌的分離鑒定，現將研究成果報道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?試劑 ?普通營養瓊脂（NA），購自北京陸橋技術有限責任公司;SS瓊脂、麥康凱瓊脂、普通營養肉湯，購自北京中海生物科技有限公司;XLT4瓊脂、TTB（四硫磺酸鈉煌綠增菌液）、BS（亞硫酸鉍）瓊脂、SC增菌肉湯、XLD瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司;沙門氏菌單因子血清購自福建寧波天潤生物藥業有限公司;微量生化反應管購自杭州天河;PCR引物，由上海英淮捷基貿易有限公司合成;Easy Pure Genomic DNA Kit核酸提取試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司;PCR反應試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司;瓊脂糖、氯化鈉、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 ?樣品的采集與處理

1.2.1 ?樣品的采集 ?采集自煙臺、威海、濰坊地區的55個祖代、父母代和商品代生產場，共計91個批次種雞群。每個場連續跟蹤4年，自2013～2016年，種雞場每批種雞孵化的健康雛雞、中途死亡毛蛋每月送檢4～6次，每次送檢25枚，從卵黃囊進行沙門氏菌分離試驗，同時每月對魚粉、籠養雞舍灰塵、平養雞舍墊料等環境樣本進行沙門氏菌分離。

1.2.2 ?環境樣本中沙門氏菌的分離 ?魚粉、飼料、墊料、灰塵樣本：無菌稱取25g樣品放入225mL的液體連四硫酸鹽增菌液或SC增菌液中，混勻，于37℃溫箱中培養24h。籠養場采集的糞便拭子、肛門拭子可以直接放入液體連四硫酸鹽增菌液中，根據送檢樣品采取5個樣品合樣;平養場鞋套法采集樣品，可用滅菌的棉簽蘸取無菌的生理鹽水使棉簽的棉團稍濕潤，涂抹鞋套采樣的一面，然后放入液體連四硫酸鹽增菌液中，根據送檢樣品采取5個樣品合樣，棉簽增菌一般采用試管增菌，試管內加入10mL增菌培養液。胎糞樣本：取1mL樣品接種至10mL增菌液試管中。增菌培養液于37℃溫箱中培養24h，接種麥康凱、SS、DHL、普通培養基進行鑒別培養，37℃培養24h后觀察記錄結果。

2 ?沙門氏菌的鑒定

2.1 ?沙門氏菌的分離純化及生化鑒定 ?在SS平板上挑取無色半透明或中間帶黑色的可疑菌落進行染色鏡檢，取上述可疑菌落分別劃線接種于普通營養瓊脂平板、DHL瓊脂平板、SS瓊脂平板以及麥康凱瓊脂、XLT4瓊脂平板上，以獲取單個菌落，置37℃溫箱培養24h再進行鑒別觀察，挑取DHL（或SS或麥康凱或普通營養瓊脂）平板上可疑單個菌落（同時在其他鑒別培養基上符合沙門氏菌特征），傳入肉湯，置37℃溫箱中培養24h后進行生化鑒定。

2.2 ?沙門氏菌單因子血清平板凝集 ?首先用A-F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照，以確定該分離菌為沙門氏菌，能夠被A-F多價O血清凝集者，再依次用O1、O2、O4、O5、O9、O12因子血清做凝集試驗后來判定O群。

H因子血清檢查包括第1相和第2相。先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以最終確定其血清型。

2.3 ?PCR鑒別

2.3.1 ?樣品DNA的提取 ?參照Easy Pure Genomic DNA Kit的使用說明提取樣品DNA，-20℃保存備用。

2.3.2 ?引物及PCR反應體系 ?根據黃金林等設計的引物（P1、P2）進行PCR擴增，P1引物序列為：5'-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G-3'，P2引物序列為：5'-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3'， 擴增目的片段為495bp，作為沙門氏菌的通用檢測方法;參照陸廣富等設計的引物（P3、P4），P3引物序列為：5'-TGT GTT TTA TCT GAT GCT GCA AGA G-3'，P4引物序列為：5'-CGT TCT TCT GGT ACT TCA GAT GAC-3'，擴增目的片段為293bp，將擴增結果與沙門氏菌生化試驗結果及分離鑒定進行比較確定最終結果。引物由上海英淮捷基貿易有限公司合成。

PCR體系為25μL：2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，ddH2O為7μL，模板為3.5μL。P1、P2 PCR反應條件為：94℃預變性5min;94℃變性1min，53℃退火2min，72℃延伸1.5min，共計30個循環;最后72℃延伸10min。P3、P4 PCR反應條件為：94℃預變性5min;94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共計30個循環;最后72℃延伸10min。

反應結束，取7μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀中觀察并記錄結果。

3 ?結果

3.1 ?2013～2016年種雞場沙門氏菌分離結果 ?2013～2016年共檢測種雞場沙門氏菌樣品107442份，其中雛雞樣品51825份、毛蛋樣品53989份、環境樣品1628份，從所有樣品中共分離到4085株沙門氏菌，沙門氏菌分離率為3.8%，見表1。沙門氏菌分離陽性樣品主要來源于毛蛋，其次是墊料和魚粉。

3.2 ?沙門氏菌的分離純化結果 ?將雛雞、毛蛋卵黃囊等樣品分別接種到營養瓊脂平板和SS平板;雞舍墊料、灰塵、魚粉等環境樣本則首先通過液體連四硫酸鹽肉湯進行預擴增，然后接種不同的鑒別培養基，經37℃ 24h培養后，挑取陽性菌落進行鏡檢，并分別劃線接種于普通營養瓊脂、DHL瓊脂、SS瓊脂以及麥康凱瓊脂等鑒別培養基上進行分離純化。沙門氏菌在普通培養基和麥康凱、SS培養基上形成直徑為2～4mm、圓形且邊緣平滑、稍隆起且有光澤菌落，在DHL培養基上則呈現中心黑色的菌落，部分菌株在SS培養基上也能長成黑色菌落，見圖1。

3.3 ?生化反應試驗結果 ?沙門氏菌革蘭氏染色可見革蘭氏陰性、平直不形成芽孢的桿菌，見圖2。沙門氏菌經鑒別培養基培養后，獲取單個陽性菌落，對于可疑菌落，繼續進行血清凝集試驗，并同時再挑取單個菌落置于肉湯中繼續培養，進行生化鑒定。

大多數沙門氏菌分離株能發酵葡萄糖（產酸和產氣）、衛矛醇、甘露醇、麥芽糖和黏酸鹽，不發酵乳糖、蔗糖、丙二酸鹽、水楊苷，不水解尿素或明膠，不產生吲哚，符合副傷寒沙門氏菌的生化特性。部分沙門氏菌不能發酵衛矛醇，而能發酵丙二酸鹽，符合亞利桑那菌的生化特性，見圖3、表2。

3.4 ?單因子血清凝集法鑒定沙門氏菌 ?參照沙門氏菌血清型與單因子血清凝集試驗結果對照表。將經生化試驗初步鑒定的菌株進行單因子血清凝集試驗以確定分型，選取部分菌株的單因子血清凝集試驗結果，如表2所示，大多數沙門氏菌分離株為腸炎沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌，與生化反應試驗結果一致。

3.5 ?PCR鑒定結果 ?挑取8個沙門氏菌菌株提取細菌基因組DNA，進行PCR反應，結果顯示：P1、P2引物均擴增出長度為495bp的條帶，符合目的片段大小，見圖4。

P3、P4引物均擴增出長度為293bp的條帶，符合目的片段大小，見圖5。8個分離株均為腸炎沙門氏菌。

3.6 ?2013～2016年分離及鑒定沙門氏菌情況 ?挑選2013～2016年部分典型菌落，經接種鑒別培養基培養以及生化反應試驗、單因子血清凝集試驗鑒定的菌株有66株，鑒定結果為：腸炎沙門菌59株，亞利桑那菌6株，疑似沙雷氏菌1株。

4 ?討論

2013～2016年規模化白羽肉種雞場共送檢107442份沙門菌樣品，共分離出4085株沙門氏菌，沙門氏菌的平均分離率為3.8%。沙門氏菌分離陽性樣品主要來源于毛蛋，其次是墊料和魚粉。毛蛋對于種雞群是否感染沙門氏菌具有明顯的病原學指示效應，雞蛋的孵化溫度為37.5℃，該溫度同樣適合細菌的繁殖，沙門氏菌在孵化雞胚中生長、擴散，更容易被檢出。歐盟27個成員國在2009年和2010年對肉雞進行沙門氏菌監測的結果表明，沙門氏菌平均分離率為5.0%和4.1%[5]。越南對302份肉雞糞便進行沙氏氏菌的檢測，沙門氏菌的檢出率是7.9%[6]。我們通過對種雞群沙門氏菌的持續跟蹤檢測，沙門氏菌分離率為3.8%，均低于歐盟和越南的分離率，這也反映出種雞群的生物安全措施明顯要好于商品代雞場。

本研究中2013～2016年規模化白羽肉種雞養殖場的沙門氏菌分離菌株以腸炎沙門氏菌為主，這與張春萍等對北京地區不同養殖場沙門氏菌的血清型研究結果一致，美國2010年從肉雞中分離的沙門菌主要以腸炎和肯塔基沙門氏菌為主，而歐盟2010年分離的血清型主要為腸炎和鴨沙門氏菌[7]。我們在規模化白羽肉種雞場并未分離到雞白痢和雞傷寒沙門氏菌，上游國外引種雞群已經實現對雞白痢和雞傷寒沙門氏菌的凈化。根據我們的研究結果證明，引進國內后的白羽肉種雞若采取良好的生物安全控制措施，可以有效預防這兩個常見病原的感染。

參考文獻：

[1] ?Y.M.Saif. 禽病學[M]（第十二版）.北京：中國農業出版社，2012：951-952.

[2] ?張燕，朱超.我國沙門菌病和菌型分布概況[J].現代預防醫學，2002，29（3）：400-401.

[3] ?陸承平.獸醫微生物學[M].北京：中國農業出版社，2001：224-225.

[4] ?鄭世軍，徐志超，李曉齊，等.一種檢測雞白痢沙門菌抗體的ELISA試劑盒[P] .CN103995126B，2015.

[5] ?Euro survellance editonal team.The European Union Summary Report on Trends and Sourees of Zoonoses，Zoonotic Agents and food-bome Outbreaks in 2010[J].EuroSurveill，2012，17（10）：71-94.

[6] ?Tran T P，Nguyen T T，et al.Prevalence of Salmonella spp in pigs， chickens and ducks in the Mekong Delta，Vietnam[J].Vet Med Sci，2004，66（8）：1011-1014.

[7] ?張純萍，寧宜寶，宋立.北京地區健康肉雞攜帶沙門菌狀況調查[J] .中國獸醫雜志，2012，46（10）：9-12.