小麥黑胚病籽粒黑變物質的理化性質分析

李巧云，姜玉梅，徐凱歌，李夢鈺，王絲雨，吳青桐

(河南農業大學國家小麥工程技術研究中心/河南省糧食作物生理生態與遺傳改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

小麥黑胚病是指小麥籽粒的胚或其周圍出現黑或褐色斑點，有時會延伸到腹溝側，甚至籽粒的冠毛端，嚴重時，整個籽粒變色皺縮[1-2]。該病害在世界不同小麥種植區廣泛發生[1-15]，不僅影響籽粒的外觀品質與面粉品質、降低種子出苗與發芽率[4-5]，而且感黑胚病籽粒還存在霉菌毒素污染問題[16-18]。近年來，隨著小麥灌漿期間環境條件的變化、品種更替以及施肥條件改善，黑胚病呈現明顯加重趨勢[6-7]，已成為影響小麥產量及品質的重要因素。

了解黑胚粒的黑變物質來源可為抗黑胚病小麥品種培育與抗黑胚病機理研究提供重要信息。研究表明，小麥黑胚病的發生、發展受致病菌的影響，麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)、鏈格孢(Alternariaalternata)等真菌為小麥黑胚病的主要致病菌[4,8-9]；小麥黑胚病的流行還與環境因素密切相關，尤其是灌漿期的高濕度與較低的溫度是該病流行的關鍵[10-11]。影響因素的多樣性使小麥黑胚病出現的機理復雜，對其產生具體原因的報道較少。

一些研究認為，黑胚病癥狀產生的原因主要是菌絲在籽粒表面積累的結果[9,12-13],如Rees 等[12]認為，黑胚病癥狀與籽粒受侵染部位菌絲密度有關；而另一些學者則認為，黑胚病癥狀產生與真菌侵染沒有直接關系[1,14-15]，如Williamson[1]將小麥籽粒先后浸泡在酚酸溶液與H2O2溶液中，在體外誘導產生黑胚病癥狀，推測黑胚癥狀的形成與酶促褐變有關。

本研究擬從小麥感黑胚病籽粒中的感病部位提取黑變物質，并對其進行理化特征分析，以探究造成黑胚病癥狀的黑變物質來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及致病菌侵染

試驗材料為來源于國家小麥工程技術研究中心遺傳育種課題組的高感黑胚病小麥品系宛原白1號，接菌條件下，該品系的發病率在50%以上[2,8]。將供試材料于2017-2018年種植在國家小麥工程技術研究中心的滎陽實驗基地，栽培條件同一般育種田。

致病菌株為B.sorokiniana的強致病菌株Ta-BP33，由國家小麥工程技術研究中心小麥抗病遺傳育種課題組分離、鑒定[8]。

接菌侵染參照李巧云等[19]的方法，將4 ℃冰箱保存的Ta-BP33置于馬鈴薯-土豆-瓊脂(PDA)培養基上，25 ℃暗培養12 d，制作孢子懸浮液用于接菌侵染；抽穗期挑選發育期一致的穗子，套袋以隔離雜菌，在花后10 d接菌并套袋保濕。成熟后收獲，挑選感病籽粒與健康籽粒用于黑變物質的提取。

1.2 黑變物質及致病菌胞外、胞內黑色素的提取

1.2.1 小麥病粒黑變物質提取

小麥籽粒黑變物質的提取與純化參考Sava等[20]的方法并略有修改。具體提取步驟：(1)將種子用水浸泡12 h，用鑷子將黑變部位皮組織(含種皮、表皮、糊粉層及少量胚乳)撕下，干燥后取2.5 g放入研缽內，加液氮研磨后，放入150 mL的三角瓶中，加90 mL去離子水，煮沸15 min后過濾；(2)在濾渣中加入100 mL 7 M的HCl，55 ℃、水解3 h后過濾；(3)將濾渣用蒸餾水沖洗至中性，加50 mL 0.1 M的NaOH,65 ℃提取4 h，重復3次至樣品無黑/褐色，于75 ℃水浴3 h，過濾，濾液離心(12 000 r·min-1，30 min)；(4) 上清用2 M的HCl調至pH 2.5，沉淀黑色素，室溫靜置2 h，離心(10 000 r·min-1， 15 min)，沉淀即為黑變物質粗提物。

純化步驟：粗提物用7 M的HCl 在100 ℃水解2 h后離心(10 000 r·min-1，10 min)，沉淀分別經水、氯仿、乙酸乙酯、乙醇洗滌后，風機風干沉淀，將其溶解在0.1 M的NaOH中，離心(6 000 r·min-1，10 min)，上清液用2 M的HCl調至pH 2.5，沉淀黑色素，水洗后重復上述過程2次，最后風機風干沉淀，于干燥器內干燥24 h后， -20 ℃保存備用。健康籽粒相同部位提取物的提取方法同病粒黑變物質。

1.2.2B.sorokiniana胞內與胞外黑色素的提取與純化

胞內黑色素(Bs-in)的提取與純化:參照Malama等[21]的方法并略作修改，將菌株在PDA培養基上黑暗培養7 d，切5片直徑3 mm的菌落接種于PDA 培養基上(pH 6.8)，25 ℃黑暗靜置培養10 d。稱取1.5 g菌絲，液氮研磨成粉未后轉移到50 mL離心管中，加入30 mL 1 M的NaOH充分混勻；沸水浴5 h后，放入-20 ℃冰箱中冷卻30 min，雙層濾紙過濾，濾液用2 M HCl調pH至2.5，10 000 r·min-1離心15 min，沉淀為黑色素粗提物。

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純化步驟：將粗提物加5 mL 7 M的HCl，充分混勻，沸水浴2 h后離心(10 000 r·min-1，15 min)，沉淀用1 M的NaOH溶解后，用2 M的HCl調溶液pH至2.5，離心(10 000 r·min-1， 15 min)，重復3次后用蒸餾水洗滌沉淀，沉淀用風機風干，干燥器內干燥24 h，-20 ℃保存。

胞外黑色素(Bs-ex)的提取與純化：參照曹志艷等[22]的方法并略作修改，在250 mL三角瓶中裝入150 mL 土豆-葡萄糖培養基(pH 10.0)，每瓶接入5片直徑約3 mm的B.sorokiniana菌落，25 ℃黑暗靜置培養10 d，培養液雙層濾紙過濾，濾液用2 M的HCl調pH至2.5，10 000 r·min-1離心15 min，沉淀為胞外黑色素粗提物，粗提物的純化同胞內黑色素。

1.3 黑變物質理化性質分析

1.3.1 黑變物質紫外-可見光譜分析

取提取物2.0 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸餾水定容至50 mL，配成40 μg·mL-1溶液，進行紫外-可見光連續掃描(200～800 nm)。

1.3.2 黑變物質紅外光吸收光譜分析

將提取物制成KBr壓片，在500～4 000 cm進行紅外光譜掃描。

1.3.3 溫度對黑變物質穩定性的影響

取提取物0.25 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸餾水定容至50 mL，配成5 μg·mL-1溶液。分別置于25 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃恒溫水浴鍋中保溫1.0 h，取出后快速冷卻至室溫，并在各樣品最大吸收值的波長下測定吸光度(OD)值。黑變物質的溫度穩定性用吸光度的變化率表示，變化率=(OD處理前-OD處理后) / OD處理前×100%。

取提取物0.25 mg，加少量 1 M的NaOH溶解后，以蒸餾水定容至50 mL，配 成5 μg·mL-1溶液，在自然光和避光條件下保存7 d，每天定時測定其吸光度值。黑變物質的光照穩定性用吸光度的變化率表示。

2 結果與分析

2.1 黑變物質的紫外-可見光譜吸收特征

小麥黑胚病感病籽粒黑變物質(BP)與健康籽粒提取物(BPF)、B.sorokiniana的胞內、胞外黑色素(Bs-in與Bs-ex)的紫外-可見光吸收光譜見圖1。從圖1可以看出，在可見光區，所有樣品沒有特征吸收峰與極值，吸收值隨波長的增大而減小；在紫外光區，所有樣品有較強的吸收，吸收值隨波長增大而降低。

來源于黑胚病病粒的黑變物質與健康籽粒提取物的吸收峰都在235 nm，且在280～300 nm處有明顯的次吸收峰，而B.sorokiniana的胞外、胞內黑色素的吸收峰在210 nm處，二者次級吸收峰出現的波長不一致，胞內黑色素的次吸收峰在270 nm附近，而胞外黑色素的次吸收峰不明顯。從紫外-可見光譜吸收特征分析，小麥黑胚病籽粒的黑變物質與致病菌B.sorokiniana的胞內、胞外黑色素有明顯不同。

2.2 黑變物質的紅外光譜吸收特征

紅外光譜可以檢測出樣品中主要功能基團的存在[20]。本研究中，來源于黑胚病粒的黑變物質與健康籽粒提取物的紅外光譜圖一致，致病菌B.sorokiniana胞外與胞內黑色素的紅外光譜圖不完全一致。小麥籽粒提取物與致病菌黑色素紅外光譜圖不同，如籽粒提取物紅外光譜圖1 658·cm-1，1 512·cm-1，1 220·cm-1等處的吸收峰在B.sorokiniana黑色素紅外光譜圖沒有(圖2)。籽粒提取物的紅外光譜圖中，3 380·cm-1附近強寬吸收峰為-OH與-NH2峰，2 925·cm-1與2 852·cm-1處的吸收峰是碳氫鍵(C-H)或脂肪族C=H的伸縮振動形成的，1 709·cm-1的較強吸收峰為C=O峰，1 512·cm-1和1 463·cm-1處的吸收峰為芳香環的吸收峰，1 220·cm-1的吸收峰為有酚的C-O的特征峰，650～860·cm-1處吸收峰較弱，表明苯環被取代，形成了共軛體系[20,22-23]。通過紅外分析，小麥黑胚病粒黑變物質有烷基、酚羥基以及羧基等官能團，表明該黑變物質為酚類物質，與王改利等[23]提取的花椒種皮黑色素的紅外光譜圖相似。B.sorokiniana胞內黑色素在3 380·cm-1、2 925·cm-1、 2 852·cm-1與1 709·cm-1處有較強的吸收峰，與玉米大斑病胞內黑色素紅外光譜圖相似，可能是屬于真菌多聚二羥萘(DHN)類黑色素[22]。

圖2 小麥提取物的紅外吸收光譜

2.3 黑變物質的溫度穩定性

從表1可以看出，各提取物的吸光度均隨著溫度的升高而降低；不同來源提取物的吸光度變化幅度不盡相同。相比較而言，來源于小麥籽粒(病粒的黑變物質及健康籽粒的提取物)的提取物吸光度變化率整體差異不大；相同溫度處理下，病粒黑變物質與健康籽粒提取物間的吸光度變化率沒有顯著差異，說明二者對溫度的穩定性較一致。相同溫度下，來源于致病菌B.sorokinian的胞內與胞外黑色素的吸光度變化率均低于來源于小麥籽粒的樣品；尤其是胞外黑色素的吸光度變化率在各處理溫度下均顯著低于其他樣品。說明來自B.sorokinian的胞內與胞外黑色素的溫度穩定性高于小麥樣品，尤其是胞外黑色素。結果表明，源于小麥感病籽粒的提取物與致病菌的黑色素不一樣。

WYB-BP與WYB-BPF分別表示感病籽粒與健康籽粒提取物；Bs-in與Bs-ex分別表示致病菌B.sorokiniana的胞內與胞外黑色素提取物。下同。

表1 溫度對提取物穩定性的影響Table 1 Effect of temperature on the stability of extract

2.4 提取物的光照穩定性

由表2可以看出，在自然光和黑暗條件下，各樣品提取物的吸光度均隨放置時間延長而下降，來源不同則下降幅度不同。放置相同時間，各提取物在黑暗條件下的吸光度大多數高于光照條件下。放置7 d后，光照下源于小麥病粒黑變物質的吸光度下降了49.8%，而暗處理的樣品吸光度下降了36.0%，源于其他3種樣品的提取物吸光度遵循相同規律，說明光照處理對提取物質的影響較大，即其耐光性較差。無論光照還是黑暗條件下，來源于病粒與健康籽粒的樣品提取物間的吸光度變化率在7 d后均沒有顯著差異。

表2 光照對提取物穩定性的影響Table 2 Effect of illumination on the stability of extract

致病菌胞內與胞外黑色素的光穩定性均顯著高于小麥籽粒提取物；兩種光處理下，病原菌胞外與胞內黑色素的吸光度變化率均無顯著差異，與小麥籽粒間有顯著差異。

3 討 論

麥類籽粒黑胚病癥狀的形成是個有爭議的問題。有研究指出，真菌致黑胚病癥狀產生的主要原因是厚厚的真菌菌絲體附著在小麥籽粒胚部使其變色[24-25]，該結論與Hyde和Galleymore[26]的“小麥籽粒冠毛端比呈現黑胚癥狀的胚部有更多菌絲體”的研究結果相矛盾；從澳大利亞的黑胚病小麥籽粒上分離最多的真菌是鏈格孢(A.alternate)，其在整個籽粒表面都能生長，其侵染之處與細胞的變色并不關聯[1]。Conner等[14]用Fusariumproliferation侵染生長在加利福尼亞的小麥，產生黑胚癥狀，然而，在北美及加拿大以外地區進行的研究沒發現黑胚籽粒上有F.proliferation；MAK等[15]對小麥黑胚粒與健康籽粒樣品進行蛋白組學分析，發現健康籽粒中與脅迫、病害及防御相關的蛋白含量高于病粒，但是病粒中并沒有鑒定出真菌與細菌來源的蛋白質。這些研究結果表明，真菌是黑胚病的病因之一，但可能不是黑胚病癥狀產生的主要原因。

Williamson[1]將小麥健康籽粒依次浸泡在酚類溶液(兒茶酚或酪氨酸)與H2O2溶液中，在體外誘導出黑胚病癥狀，表明黑胚病癥狀可能與酶促褐變有關。推測小麥籽粒出現黑胚癥狀的機理可能為：由于不利的環境因素(如病菌侵染、灌漿期高濕環境引起的穗發芽、或者其它的傷害)存在，小麥籽粒細胞中產生過量的活性氧(ROS)，這些過量的ROS不能及時被清除，引起氧化損傷，使本來分布于不同細胞器中的酚酸物質與過氧化物酶(POD)或多酚氧化酶(PPO)結合，產生醌類物質，醌類發生自聚合或與多種氨基酸或蛋白質反應形成有色終產物[27-28]，病粒中較低含量的抗脅迫相關蛋白意味著其抗脅迫能力較弱[15]，從而產生較多的次級代謝物以提高抗脅迫能力，酚類物質是植物體內重要的次生代謝物，在抵抗生物脅迫和非生物脅迫中起重要的作用[29]。這與本研究中黑變物質紅外光譜圖反應其可能為酚類物質的結論是一致的，而且，該物質的理化性質與來源于致病菌B.sorokinian的胞外與胞內黑色素不同，這表明引起黑胚癥狀的黑變物質應該不是真菌菌絲累積或者真菌分泌到籽粒上的胞外黑色素。

來源于黑胚粒的黑變物質與來源于健康籽粒相同部位的提取物具有相同的紫外吸收特征、紅外吸收譜，相似的光、熱穩定性，表明二者很可能是同一種物質，只是健康籽粒中提取物的得率很低(數據未發表)，這提示小麥黑胚病病粒的黑變物質應該是由小麥籽粒本身合成的，健康籽粒中也可以合成，只是量較少，沒有產生肉眼可見的黑或褐色變化。

本研究認為，引起小麥黑胚病癥狀的黑變物質是小麥籽粒本身合成的，可能是酚類物質，其具體的化學成分有待于進一步的研究。更多相關研究才能更好的揭示小麥黑胚病的黑變機理。