利用人工合成小麥RIL群體進行小麥穗長和穗寬性狀的QTL分析

水志杰,安沛沛,劉天相,吳洪啟,劉 樂,史 雪,王中華

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

麥穗是小麥籽粒的唯一載體，小麥穗長與小穗數、穗粒數及千粒重等產量性狀緊密相關。有小麥育種家指出，要將穗長作為小麥品種培育過程中的重要衡量指標進行研究和利用，在考種環節中要將小麥穗長作為一個重要的農藝性狀進行測量和分析[1-2]。曹 東等[3]以兩個人工合成小麥改良品種構建的F2群體為試驗材料，在2D、3B和5B染色體上定位到4個與穗長相關的QTL；侯立江[4]以普通小麥和超小穗小麥為親本構建的F2群體為試驗材料，檢測到8個加性QTL，并認為其中位于3A染色體上的QTL很可能控制穗長性狀。前人的研究內容多集中于小麥穗長性狀，卻對控制穗長的基因少有報道。宋 楠[5]對冰草不同性狀進行研究，指出穗寬與小穗數緊密相關，但關于小麥穗寬性狀的研究鮮有報道。因此，通過構建超高密度遺傳圖對小麥穗長、穗寬性狀進行研究仍有必要。

隨著育種進程的不斷推進，優勢基因被重復利用，使得普通小麥的遺傳多樣性愈發狹窄[6]。山羊草作為普通小麥的祖先種之一，具有抗病、抗蟲和抗旱等特征，而人工合成小麥則是由四倍體硬粒小麥(Triticumdicoccoides，AABB)與山羊草(Aegilopstauschii，DD)經人工雜交創制而成。人工合成小麥與普通六倍體小麥(TriticumaestivumL.,AABBDD)雜交，可以將人工合成小麥中的優異基因轉移到普通小麥中[7]，是利用野生基因資源的重要橋梁[8]。挖掘利用人工合成小麥的優異基因，對拓寬現代小麥育種基因資源，豐富小麥遺傳多樣性具有重要意義。自20世紀90年代，國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)利用山羊草和硬粒小麥創制人工合成小麥以來，使用人工合成小麥對普通小麥進行遺傳改良，已成為許多國家小麥育種工作的重要內容[9]。張 颙等[10-11]在研究中指出，利用來自CIMMYT的人工合成小麥與本地普通小麥經雜交選育的川麥42與川麥38具有高產、高抗的優良特性，對普通小麥的品種改良和培育極具指導意義。

本試驗以人工合成小麥和普通小麥為親本構建了F7∶8RIL群體，基于小麥55K SNP芯片對F7RIL群體構建遺傳圖譜，對穗長和穗寬性狀進行QTL定位及遺傳分析，為挖掘新的基因位點以及利用人工合成小麥對栽培種小麥進行遺傳改良提供參考，同時也為進一步開展對目標性狀的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料包括人工合成小麥KU98、普通栽培小麥西農389以及由西農389 × KU98創制的包含152個F7∶8重組自交系(Recombinant inbred lines,RILs)群體，由西北農林科技大學胡銀崗教授提供。其中，KU98的穗子長而窄，西農389的穗子短而寬(圖1)，KU98由來自伊朗的粗山羊草(代號KU-2098)與四倍體硬粒栽培種小麥品種Langdon雜交獲得。

圖1 西農389和KU98的穗部性狀

1.2 方 法

1.2.1 田間種植及性狀調查

2017年(F7)和2018年(F8)分別將RIL群體及其親本種植在陜西楊凌西北農林科技大學北校區試驗田。采用隨機區組設計，設置三次重復，每株系種植1行，行長 1 m，行距 25 cm，株距 10 cm。于小麥成熟后，分別從每個株系中選取5株長勢一致的小麥，對其主莖的穗長和穗寬進行測量，穗長的測量值為穗柄至穗尖的長度，穗寬的測量值為最寬小穗的寬度，均以直尺進行測量，穗長和穗寬的測量值均不包含芒長。

1.2.2 DNA樣品制備

取F7∶8RIL群體及2個親本苗期葉片，采用CTAB法[12]提取DNA，使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，利用微量核酸測定儀(NanoDrop One，Thermo ScientificTM)檢測DNA 濃度。

1.2.3 芯片數據分析

小麥55K SNP芯片分型分析及樣品質檢工作由北京博奧晶典生物技術有限公司完成，小麥55K SNP芯片包含53 063個SNP標記，覆蓋小麥的21對染色體。采用Genomestudio v1.0 軟件進行多態性分析獲得基因型數據后，在兩個親本間進行多態性標記篩選，根據QTL IciMapping V4.1作圖軟件(www.isbreeding.net)對基因型數據格式的要求，在RIL群體中分別將與母本相同的標記記為0，與父本相同的標記記為2，將分型失敗的標記記為-1，雜合基因型記為1。

1.2.4 表型數據分析

用Excel 2016對F7∶8RIL群體穗長和穗寬的表型值進行匯總和均一化處理，利用IBM SPSS Statistics 18數據分析軟件對穗長和穗寬的表型值進行方差分析及正態分布檢驗。

1.2.5 遺傳連鎖圖譜構建及QTL分析

基于小麥55K SNP芯片分型結果與表型分析結果，利用QTL IciMapping 4.1軟件對RIL群體各株系的基因型進行遺傳連鎖分析并作圖，利用Kosambi作圖函數將重組率轉換為遺傳距離(cM)[13]。在此基礎上，使用軟件的BIN程序以20%為缺失率(missing rate)的閾值去除缺失率較高的標記及冗余標記，使用MAP功能對SNP標記進行分析并繪制遺傳連鎖圖，默認掃描步長為1 cM，顯著檢驗水平為0.05，排列檢驗次數為1 000，利用SDL功能對參與作圖的標記進行卡方檢驗，檢驗RIL作圖群體是否符合理論分離比率(1∶1)[14]，在BIP功能程序中默認LOD為2.5，選擇完備區間作圖法(ICIM-ADD)對目標性狀進行QTL定位和加性遺傳效應分析。最后使用Map Chart 2.2繪制遺傳連鎖圖及中國春小麥參考基因組物理圖譜(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)。

QTL命名方式參考Mccouch等[15]的方法，即QTL + 性狀英文名稱+ 染色體英文名稱 + QTL數目，其中所有名稱均使用英文縮寫表示，如qSL-1A.1表示位于1A染色體上第1個與穗長相關的QTL。如果QTL的表型變異解釋率(PVE%)大于10%，則認為該QTL為主效QTL。

2 結果與分析

2.1 親本及F7∶8 RIL群體性狀變異分析

由表1可知，2018和2019年，父本KU98的穗長分別為13.78 cm和14.84 cm，穗寬分別為0.70 cm和0.92 cm，母本西農389的穗長分別為8.92 cm和9.08 cm，穗寬分別為1.60 cm和 1.64 cm。t檢驗表明穗長和穗寬性狀在父、母本間具有極顯著差異。對2018和2019年RIL群體穗長和穗寬性狀的表型值分別進行單樣本 Kolmogorov-Smirnov檢驗，P值(K-S檢驗值)均大于0.05，說明目標性狀在F7∶8RIL群體中呈連續分布，且符合正態分布(表1、圖2)。因此，可以利用此RIL群體對目標性狀進行QTL定位 分析。

表1 親本及RIL群體表型變異分析Table 1 Phenotypic variation in parents and RIL population

2.2 高密度遺傳連鎖圖構建及分析

本研究所使用的小麥55K SNP芯片由小麥660K SNP芯片優化而來。基于芯片分型的結果，對親本(西農389×KU98)進行多態性標記篩選，共得到23 785個純合的多態性標記，利用QTL IciMapping軟件對F7RIL群體全部株系的標記數據進行遺傳圖譜的構建，使用軟件的BIN功能去除冗余標記后，共獲得4 831個參與遺傳圖譜構建的標記。

利用本試驗群體所構建的遺傳圖譜包含26個連鎖群，覆蓋小麥21條染色體，全基因組總遺傳距離為7 960.26 cM，平均標記密度為1.65 cM。2D染色體存在最大的連鎖群，由327個SNP標記構成，長度為609.18 cM；7B染色體存在一個最小連鎖群，由6個SNP標記組成，標記區間長度為13.2 cM，平均標記密度為2.20 cM。A、B、D三個亞基因組的標記數目分別為1 647、 1 707和1 477個(表2)。構建遺傳圖譜的群體基因型標記經過軟件SDL程序的卡方檢驗(2)后，其親本基因型在群體中的分離比分別為 1∶1.11，接近理論分離比1∶1，符合遺傳作圖的要求。

表2 高密度遺傳圖譜信息Table 2 Summary of high-density linkage map

A和C分別表示F7 RIL群體穗長和穗寬性狀的表型頻率分布；B和D分別表示F8 RIL群體穗長和穗寬性狀的表型頻率分布。

2.3 小麥穗長及穗寬性狀的QTL定位及分析

基于已構建的遺傳連鎖圖譜和兩年的表型數據對RIL群體的穗長和穗寬性狀進行加性QTL分析，結果見表3和圖3。

2018年檢測到3個與穗長性狀相關的QTL，分別位于2D、5A和7B染色體上，其加性效應均為正值。2019年檢測到7個與穗長相關的QTL位點，分別位于1A、2D、3A、5A和7B染色體，除qSL-1A.1和qSL-7B.3外，其余位點加性效應均為正值，其中，3個主效QTL的貢獻率大于10%，分別為qSL-1A.2、qSL-5A.2和qSL-7B.2，對應的標記區間分別為AX-110944881～AX-111592607、AX-108792246-AX～111048027和AX-111650139～AX-110087763，LOD值分別為16.35、16.68和18.00。

2018年檢測到6個與穗寬性狀相關的QTL，分別位于2D、4D、5A、6A和7D染色體上，其中，qSW-2D.1和qSW-5A.1均為主效QTL，分別位于2D和5A染色體上，標記區間分別為AX-89728114～AX-109842248、AX-108792246～AX-111048027，LOD值分別為9.54和13.94，貢獻率分別為10.16%和16.38%。2019年檢測到4個與穗寬相關的QTL，分別位于2D、4D、5A和7D染色體上，位于5A染色體上的qSW-5A.1為主效QTL，標記區間為AX-108792246～ AX-111048027，貢獻率為26.25%，LOD值為14.74，檢測到的所有與穗寬性狀相關的QTL位點的加性效應均為負值。

為了對定位結果進行綜合分析及方便與前人研究結果進行比對檢驗，將本研究中穗長和穗寬性狀的定位結果與普通小麥中國春的物理圖譜進行比對。由于連鎖群及其標記過多，故僅選取1A、2D、4D、5A和7B連鎖群10%～20%的標記在Map Chart軟件中進行繪圖(表3、圖3)。比對結果發現，三個與穗長相關的主效QTL(qSL-1A.2、qSL-5A.2、qSL-7B.2)分別位于1A染色體的51 966.53～54 498.55 kb區間、5A染色體的646 360.11～651 554.41 kb區間和7B染色體的12 587.55～12 966.27 kb區間。兩個與穗寬相關的主效QTL(qSW-2D.1、qSW-5A.1)分別位于2D染色體的23 102.53～26 344.37 kb區間和5A染色體的646 360.11～651 554.41 kb區間。此外，比對結果還發現，位于2D染色體的4個QTL分布較為集中，其中qSL-2D.1兩年定位區間均位于2D染色體的30 493.66～ 31 582.96 kb區間，標記區間均為AX-111939856～AX-111497351，說明qSL-2D.1是一個穩定的微效QTL；qSW-2D.1和qSW-2D.2在連鎖圖譜和物理圖譜的分布較近，認為在2D染色體的15 433.40～21 554.25 kb區間存在與穗寬相關的QTL。位于4D和5A染色體的qSW-4D.1(位于4D染色體的439 696.45～439 870.27 kb區間)和qSW-5A.1兩年間的定位結果一致，說明qSW-4D.1和qSW-5A.1分別是穩定的微效QTL和主效QTL。而位于7B染色體的qSL-7B.2的物理區間與qSL-7B.1(位于7B染色體的11 725.56～13 704.17 kb)完全重疊，且qSL-7B.2與qSL-7B.1標記區間的遺傳距離較近(4.12 cM)，認為兩者為同一位點。

表3 2018和2019年穗長和穗寬性狀的加性QTL分析Table 3 Additive QTL analysis of spike length and spike width in 2018 and 2019

3 討 論

作圖群體親本的選配是構建遺傳連鎖圖譜的基礎，親本間的遺傳差異與定位結果的準確性緊密相關[16]。本研究中RIL群體的母本西農389由多個親本經復交和有限回交選育而成，遺傳基礎豐富，父本KU98由硬粒小麥和山羊草經人工雜交創制而成，兩者的遺傳背景差異明顯，為進行有效地QTL定位奠定良好基礎，同時RIL群體可以作為永久作圖群體繼續進行多年多點的QTL檢測。

遺傳圖譜是QTL定位和遺傳分析的重要工具。本研究使用商業化的小麥55K SNP芯片對F7∶8RIL作圖群體進行掃描，構建了包含4 831個多態性SNP標記的高密度遺傳連鎖圖譜，父母本基因型在作圖群體中的分離比為1∶1.11，接近理論遺傳分離比，說明群體在人工選擇構建的過程中未出現偏分離，A、B、D三個亞基因組的標記分別為1 647、1 707和1 477個。崔德周等[17]基于90K SNP芯片對萊州953 ×山農輻63組合構建的F2群體進行遺傳圖譜繪制，其標記數目在基因組的分布為B>A>D，與本研究標記分布趨勢一致。而崔德周等[17]的研究結果指出，標記數目在三個基因組的分布并不平衡，但在本研究中三個亞基因組的標記數目接近，造成這一差異的原因是本研究使用的小麥55K SNP芯片與90K SNP芯片標記分布不同。55K和90K SNP芯片是我國目前主流的小麥商用芯片，90K SNP主要面向歐美小麥品種進行設計，且其硬粒小麥和山羊草等近緣種的SNP標記只有十分之一左右，標記在基因組的分布并不平衡。而55K芯片標記SNP由660K芯片經優化篩選而來，其標記A、B、D基因組的分布更為均勻，作為高密度的經濟優惠型芯片，更加適合對中國小麥進行多樣本檢測。

穗長性狀與穗粒數關系密切[18]，間接影響小麥產量。前人對小麥穗長性狀的研究報道指出，小麥穗長性狀相關QTL在1AS、1BL、2A、2BL、2DL、3A、3B、4B、5B和7A等多條染色體均存有分布[19-22]。武炳瑾等[23]利用周 8425B與小偃81雜交構建的F8RIL群體和90K SNP芯片在三個環境條件中共檢測到18個與穗長相關的QTL位點，分布于1A、1D、2B、2D、3A、3B、4A、5B、6A、6B、7A、7B 和 7D 染色體上，包含9個主效QTL，其中qSL.NAFU-6A.2和qSL.NAFU-7A是位于6A和7A染色體的環境穩定性主效QTL。李 聰等[23]利用55K SNP芯片和普通小麥構建的F6 RIL群體經過多年多點試驗，檢測到27個與穗長相關的QTL，分布于1A、1D、2B、2D、3A、4A、4B、5A、5B、6A和7D染色體，其中共檢測到4個與穗長相關的穩定主效QTL，分別位于2D和4B染色體。其中，qSL-SAU-2D.1的標記區間為AX-111096297～AX-109422526，其物理位置在2D染色體上32.97 Mb處，與本研究中qSL-2D.1的物理區間(2D染色體的30 493.66～ 31 582.96 kb)比較接近，推測這兩個位點之間存在與穗長性狀相關的QTL。本研究連續兩年在2D、5A和7B染色體檢測到穗長相關的QTL，其中qSL-2D.1兩年檢測到的標記區間一致，qSL-7B.1與qSL-7B.2的標記區緊密相鄰，并且兩者的物理區間重疊，所以認為qSL-7B.1與qSL-7B.2為同一位點。本研究中與穗長性狀相關的穩定QTLqSL-2D.1與李 聰等[24]的定位結果相同，而與武炳瑾等[23]的研究結果存在一定差異，推測造成這種差異的原因有兩點，一是本研究中作為父本的人工合成小麥遺傳背景與普通小麥不同，二是本研究還缺少對目標性狀多點環境下的檢測。武炳瑾等[23]對檢測到的與穗長性狀相關的QTL進行加性效應分析，認為穗長性狀的有利變異來源于父本(小偃81)，該觀點與本研究的分析結果一致。

F7群體QTL定位結果用藍色表示；F8群體QTL定位結果用紅色表示。

穗寬作為穗部性狀之一，宋 楠[5]在對小麥近緣種之一的冰草進行了多個性狀的研究分析，指出穗寬與小穗數具有正相關關系，說明穗寬也會對產量產生影響。而目前對小麥穗寬性狀的QTL定位研究鮮有報道，本研究經過連續兩年的表型調查統計，發現兩年間均檢測到與穗寬性狀相關的qSW-4D.1與qSW-5A.1，表明它們是可靠的QTL位點，且qSW-5A.1兩年的貢獻率分別高達16.38%和26.25%，是一個穩定的主效QTL，此外，qSW-5A.1與qSL-5A.2標記區間相同，推測該位點具有一因多效的遺傳效應或連鎖遺傳關系，該研究結果為穗寬性狀的進一步研究奠定了基礎。