重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶發酵條件優化

趙婷，黃禮清，金紫陽，袁思棋*，劉君,2,3*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000)2(宜賓五糧液集團有限公司，四川 宜賓，644000) 3(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610000)

雙乙酰(diacetyl)，又稱2,3-丁二酮，是一種具有特殊氣味的黃綠色油狀液體，廣泛存在于郁金香、草莓和薰衣草等天然植物內，以及奶油、奶酪、酸奶等乳制品中[1]。2分子丙酮酸在乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS, EC 4.1.3.18)作用下產生1分子α-乙酰乳酸(α-acetolactate, α-AL)，再經過非酶催化脫羧生成雙乙酰[2-4]。雙乙酰在工業應用廣泛，例如，在奶油風味食品的生產過程中，主要通過添加化學工業生產的雙乙酰作為食品添加劑，從而改善食品的風味。但是，化學工業生產雙乙酰的過程一般需要涉及亞硝酸酯等有毒物質；另一方面，雙乙酰具有很強的揮發性，一次性添加不能使食品的風味持續很久[5]。

在發酵過程中，能夠表達α-乙酰乳酸合成酶的菌株(如乳酸乳球菌)的酶產量有限，不能滿足當前食品市場非常巨大的需求[6-7]。因此，為了提高乳酸菌發酵過程中雙乙酰的產量以及延長雙乙酰風味的作用時間，更健康、安全的方法是添加乙酰乳酸合成酶酶制劑[5]。常用的工程菌自身組成性表達的乙酰乳酸脫羧酶會不可逆地催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻，很大程度上降低了雙乙酰的產率。研究報道，通過基因工程過表達α-AL編碼基因或在天然產雙乙酰的菌株中過表達α-AL編碼基因，增加雙乙酰合成途徑的通量，可以有效提高雙乙酰的產率[1]。大腸桿菌不僅沒有乙酰乳酸脫羧酶基因，不具有催化乙偶姻生成的能力，而且具有培養周期短、代謝易控制、營養要求粗放等許多優勢，較適合作為雙乙酰生產的工程菌[8-9]。

本實驗室篩選得到1株高產乙酰乳酸合成酶的地衣芽孢桿菌T2，從T2中克隆獲取乙酰乳酸合成酶基因alsS，構建重組質粒pEGX-6p-1-alsS，并轉化到E.coliBL21(DE3)進行異源表達，并對重組alsS的發酵條件進行優化，獲得重組目的基因的最佳表達條件，提高具有活性的乙酰乳酸合成酶產量。從而為后續酶降低酶制劑生產成本奠定基礎，增強雙乙酰的合成代謝流，使得利用微生物更安全、更環保地進行雙乙酰生物合成生產[7,10-11]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

E.coliBL21(DE3)/pEGX-6p-1-alsS，作者所在實驗室構建并保存。

1.1.2 培養基

種子培養基為LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10；發酵基礎培養基(g/L)：葡萄糖5，酵母浸粉5，蛋白胨5，NaCl 5。使用250 mL搖瓶，裝液量為50 mL。將上述基礎培養基中碳源、氮源及無機鹽替換成不同的成分以進行發酵培養基優化。

1.1.3 試劑

發酵培養基各成分，上海源葉生物技術有限公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、氨芐青霉素，購自生工生物工程股份(上海)有限公司。

1.1.4 儀器與設備

UV-1800分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將甘油管保藏菌種接入LB培養基中，37 ℃、200 r/min過夜培養；按體積分數5%接入發酵(基礎)培養基中，37 ℃、200 r/min繼續培養至OD600為0.6～0.8時，加入0.2 mmol/L IPTG，于25 ℃誘導培養6 h。

1.2.2 重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的發酵條件優化

參照1.2.1的方法培養重組大腸桿菌，LB培養基中培養種子液，以體積分數2%接種量接入發酵(基礎)培養基中，37 ℃、180 r/min繼續培養至OD600為0.6～0.8時，加入1 mmol/L IPTG，于30 ℃誘導培養6 h。誘導培養結束后，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，以工程菌作為對照。

1.2.3 菌體吸光度分析

將所得菌懸液稀釋適當倍數，UV-1800分光光度計測定其吸光值，如公式(1)所示：

OD600=讀數×稀釋倍數

(1)

1.2.4 菌體生物量的測定

為考察單位菌體產酶量參數，建立了OD600與菌體質量濃度(g/L)的線性關系。取相同體積不同濃度的菌體，測定其OD600后，8 000 r/min離心10 min，棄上清，用去離子水懸浮菌體，再離心，棄上清，將菌體放置于70 ℃烘干至恒重。

1.2.5 菌體破碎

誘導培養結束后，離心收集菌體，用7.5 mL K3PO4緩沖液(100 mmol/L，pH 6.0)懸浮菌體，使用超聲波破碎儀處理10 min后置于 4 ℃、8 000 r/min、離心20 min，取上清液進行酶活測定。

1.2.6 重組蛋白質酶活力的測定

酶活測定：乙酰乳酸在一定溫度條件下會脫羧形成乙偶姻，而乙偶姻在堿性條件下可以與肌酸和α-萘酚的混合物反應生成紅色物質，在525 nm有吸光度[12]。反應體系為l mL 100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)，其中含40 mmol/L的丙酮酸鈉，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L TPP，10 μmol/L FAD，37 ℃加入20 μL 酶液，10 min后加50 μL 3 mol/L H2SO4終止反應，37 ℃脫羧25 min，2 000 r/min離心1 min，上清稀釋20倍后取200 μL加入1 mL 1.7 g/L肌酸和1 mL 17 g/L的α-萘酚，37 ℃顯色 30 min，于525 nm處測定吸光度[13]。乙偶姻的標準曲線方程為：y=0.060 2x+0.095 5(R2=0.995 1)，其中x為乙偶姻濃度(μmol/L)，y為OD525值。酶活單位(IU)定義為在37 ℃條件下，1 min內催化生成 1 μmol/L乙偶姻所需的酶量。

1.2.7 單因素實驗

1.2.7.1 碳源及質量濃度對重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的影響

根據已有文獻[14]進行優化，分別以葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖(質量濃度均是5 g/L)為發酵培養基的碳源，以酵母浸粉5 g/L和蛋白胨10 g/L為發酵培養基的氮源，測定酶活力，確定最佳碳源。在最佳碳源的基礎上，根據文獻[10]選擇添加量(質量濃度)4、6、8、10、12 g/L，確定最佳濃度。

1.2.7.2 氮源及質量濃度對重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的影響

在最佳碳源及濃度的基礎上，分析氮源添加條件對菌體生長及產酶的影響：(1)僅添加無機氮源(NH4)2SO4和NH4Cl(各3 g/L)；(2)僅添加有機氮源牛肉膏；(3)酵母膏；(4)蛋白胨及牛肉膏蛋白胨組合；(5)牛肉膏酵母膏組合;(6)酵母膏蛋白胨組合。根據以上結果，分別測定對應條件下酶活力，確定最佳氮源。在此基礎上，根據文獻資料[15]選擇添加量5、10、15、20、25 g/L，確定最佳質量濃度。

1.2.7.3 無機鹽離子及質量濃度對重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的影響

無機鹽對微生物有非常重要的生理功能，可作為酶的激活劑或輔基，并且在維持滲透壓、pH的穩定以及組成細胞物質等方面均有重要體現[16]。最佳碳源及氮源的種類和添加量確認后，以產酶水平為考察指標，使用正交實驗設計對無機鹽種類及濃度進行優化。選用4種常用的無機鹽(檸檬酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl)對菌體生長及產乙酰乳酸合成酶的影響[15]。

1.2.8 重組大腸桿菌誘導表達條件優化

甘油管菌種接種于5 mL LB Amp+培養基37 ℃活化過夜, 將活化的菌種接種于LB Amp+培養基中，37 ℃、 200 r/min培養，分析以下不同發酵條件對工程菌生長和目標蛋白表達的影響[17-19]：(1)改變加入IPTG誘導劑的培養時間；(2)加入不同濃度的IPTG誘導劑；(3)改變加入IPTG誘導劑的培養溫度；(4)改變接種量；(5)改變培養基的pH；(4)改變培養搖床的轉速。

1.2.9 響應面Box-Behnken試驗設計

基于單因素實驗結果，選擇對產酶水平影響較大的3個因素，通過 Box-Behnken 法設計出3因素(pH、溫度、IPTG濃度)、3水平正交實驗。pH的3水平分別為6、7和8；溫度的3水平分別為25、 30、 37 ℃；IPTG濃度的3水平分別為0.2、 0.4、0.6 mmol/L(表1)。

表1 基于 Box-Behnken 設計的 3 因素 3水平正交實驗表Table 1 Design and protocol of the three-variable/three-level Box-Behnken method

2 結果與分析

2.1 菌體干重與OD600的線性關系

根據1.2.4實驗方法處理，獲得菌體干重(g/L)與OD600回歸方程，y=0.376 7x-0.015 9(R2=0.999 3)，其中x為OD600，y為菌體干重(g/L)。

2.2 發酵培養基的優化

2.2.1 碳源對菌體生長及產酶的影響

由表2可知，菌體質量濃度在6種不同碳源培養基中，淀粉最高，依次是甘油、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，乳糖最低。當葡萄糖作為碳源時，單位菌體產酶量及產酶水平均最高，其他碳源對應的單位菌體產酶量及產酶水平均低于葡萄糖。

表2 不同碳源對重組大腸桿菌菌體生長及產酶的影響Table 2 Effects of different carbon sources on the growth and enzyme production of recombinant E. coli

通過不同碳源影響因素的確定，隨著不同葡萄糖添加質量濃度增加，單位菌體產酶量呈小幅度增加，而產酶水平呈明顯增加趨勢(圖1)，即當葡萄糖質量濃度為12 g/L時，單位菌體產酶量及產酶水平分別為112.990 kU/g和122.779 U/mL。

圖1 不同葡萄糖質量濃度對乙酰乳酸合成酶活力的影響Fig.1 Effects of different glucose concentrations on acetolactate synthase activity

2.2.2 氮源對菌體生長及產酶的影響

重組大腸桿菌可以有效利用有機氮源和無機氮源。由表3可知，重組大腸桿菌對單一有機氮源的利用效率高于無機氮源，而混合的有機氮源利用效率較低。根據表3數據顯示，(1)無機氮源NH4Cl的單位菌體產酶量和產酶水平明顯比(NH4)2SO4高；(2)單一有機氮源中，蛋白胨對應的菌體質量濃度、單位菌體產酶量和產酶水平均高于牛肉膏和酵母膏；(3)混合有機氮源中，除單位菌體產酶量外，牛肉膏+酵母膏組合的菌體質量濃度和產酶水平均高于其他2種組合。綜合考慮有機氮源和無機氮源實驗數據和實驗成本，最終確定本實驗培養基僅需添加蛋白胨作為唯一氮源。

表3 不同氮源對重組大腸桿菌菌體生長及產酶的影響Table 3 Effects of different nitrogen sources on the growth and enzyme production of recombinant E. coli

在確認最佳氮源后，探討不同質量濃度的蛋白胨對單位菌體產酶量及產酶水平的影響情況。結果顯示，隨著蛋白胨濃度的不斷升高，大腸桿菌單位菌體產酶量及產酶水平先增加，后逐漸降低，即當蛋白胨質量濃度為10 g/L時，單位菌體產酶量及產酶水平均為最高(圖2)。因此，確定蛋白胨10 g/L作為最佳蛋白胨添加量。

圖2 不同蛋白胨濃度對乙酰乳酸合成酶活力的影響Fig.2 Effects of different glucose concentrations on acetolactate synthase activity

2.2.3 無機鹽對菌體生長及產酶的影響

不同的無機鹽離子對微生物的生長有不同的影響。由表4可知，檸檬酸鈉對產酶的影響最顯著(R值為50.3)，其他無機鹽依次為 NaCl(11.59)，KH2PO4(11.16)，MgSO4·7H2O(8.21)，其中MgSO4·7H2O對產酶的影響最小。檸檬酸是三羥酸循環的關鍵物質，推測檸檬酸鈉的添加可以為細胞生長提供能量，也可促進細胞的產酶。細胞干重隨檸檬酸鈉質量濃度的增大而增大，產酶水平及單位菌體產酶量也逐漸提高。根據不同無機鹽離子的正交實驗，最優組合為A3B2C1D3，即檸檬酸鈉0.25 g/L， KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L。

表4 無機鹽優化正交實驗與結果Table 4 Orthogonal experiments and results of inorganic salt optimization

2.3 誘導條件的優化

2.3.1 接種量、pH和培養轉速的優化

由圖3可知，隨著接種量、培養基pH值和搖床轉速的增加，重組大腸桿菌單位菌體產酶量和產酶水平均呈現先增加，后降低的趨勢，即在接種量0.04%、pH=7和搖床轉速180 r/min時，對應的單位菌體產酶量和產酶水平達到最高。

a-接種量；b-pH；c-培養轉速圖3 接種量、pH和培養轉速對單位菌體產酶量和產酶水平的影響Fig.3 Effects of inoculation , pH and culture rotation speed on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.2 誘導溫度的優化

根據實驗用大腸桿菌的培養溫度情況，選擇18、25、30、37 ℃ 4個誘導溫度進行優化實驗，結果表明，隨著溫度的升高，單位菌體產酶量和產酶水平呈現先增加后降低的趨勢，即當誘導溫度為30 ℃時，單位菌體產酶量與產酶水平均最高(圖4)。因此，最終選定30 ℃為最適誘導溫度。

圖4 誘導溫度對單位菌體產酶量和產酶水平的影響Fig.4 Effects of induced temperature on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.3 誘導劑 IPTG 濃度的優化

在重組大腸桿菌菌株生長過程中，添加誘導劑IPTG促進菌體中基因表達。根據先前實驗室重組菌株的實驗，選擇IPTG濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L進行誘導實驗，由圖5可知,隨著誘導劑IPTG濃度的增加，單位菌體產酶量和產酶水平呈先增加后減少的趨勢；當IPTG濃度為 0.4 mmol/L時，產酶水平最高，達到314.724 U/mL。因此，最終確定誘導劑IPTG的最佳濃度為0.4 mmol/L。

圖5 不同濃度的誘導劑IPTG對單位菌體產酶量和產酶水平的影響Fig.5 Effects of different IPTG concentration on the enzyme production per unit and production level of recombinant E. coli

2.3.4 誘導時間的優化

本次實驗的重組大腸桿菌菌株的最佳誘導表達時間以9 h為誘導時間中間值，分別設置5個時間梯度，由圖6可知，隨著誘導時間的不斷延長，單位菌體產酶量和產酶水平在誘導2～10 h均呈現增長趨勢，10 h后均呈現下降趨勢。因此以10 h誘導時間作為最佳誘導表達時間。

圖6 不同誘導時間對單位菌體產酶量和產酶水平的影響Fig.6 Effects of induced time on the enzymic production per unit and production level of recombinant E. coli

2.4 響應面優化重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶

2.4.1 回歸模型的建立和方差分析

表5 響應面試驗設計Table 5 Results of response surface design and corresponding analysis

從分析軟件Box-Behnken 程序擬合獲得的交互二次回歸方程F檢驗和失擬檢驗(表6)，模型P= 0.000 2 < 0.01(極顯著)，說明模型呈現極顯著；失擬項P= 0.057 > 0.05(不顯著)，說明該模型與試驗擬合程度好，誤差較小，可以用此模型進行乙酰乳酸合成酶的產酶水平分析和預測。從各個因素顯著性水平差異可知，對乙酰乳酸合成酶的產酶水平影響順序依次為IPTG濃度>pH>溫度，特別是IPTG濃度對乙酰乳酸合成酶的產酶水平影響達到了極顯著水平(P<0.01)，而pH和溫度2個因素對產酶水平的影響不顯著。

表6 響應面試驗的回歸方程方差分析Table 6 Results of response surface design based on the ANOVA of the regression equation

2.4.2 響應面分析

根據分析軟件Box-Behnken 程序擬合獲得的交互二次回歸方程得出不同因素的響應面和等高線分析結果如圖7所示。由各模型參數可知，X1、X2、X3的二次方項對重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶有極顯著的影響，而各因素之間的相互作用對乙酰乳酸合成酶量影響不顯著。根據響應面圖和等高線圖趨勢，經對比分析得出，在追求高水平產酶效率時，在因素pH(X1)保持穩定的情況下，應考慮溫度(X2) 與IPTG濃度(X3)的交互作用。

2.4.3 驗證試驗

通過回歸方程和響應面預測重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的發酵最優條件為pH 7.0、溫度30.2 ℃，IPTG濃度為0.42 mmol/L，該優化條件下乙酰乳酸合成酶產酶水平為237.081 U/mL。經發酵實驗驗證，以預測條件做3次平行實驗，得到最高的產酶水平為242.567 U/mL，與模型的預測值相近，無顯著性差異，說明該模型能夠準確地預測重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的發酵條件，也可以獲得較高產酶水平。

2.4.4 最優誘導條件下不同培養基中菌體生長及產酶比較

前述實驗內容的優化條件組合后，利用最佳優化條件確定了最優發酵培養基的組成成分如下：葡萄糖10 g/L，蛋白胨15 g/L，檸檬酸鈉 0.25 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L。根據優化后的誘導條件進行發酵實驗，對比重組菌在發酵優化培養基、LB培養基中菌體生長及產酶情況，結果顯示優化后培養基的菌體質量濃度、單位菌體產酶量和產酶水平均優于LB培養基(表7)，分別達到1.623 g/L、164.299 kU/g和266.657 U/mL，是原LB培養基的1.35、1.31和1.77倍。

a-pH與溫度交互圖；b-pH與溫度平面圖；c-pH與IPTG濃度交互圖；d-pH與IPTG濃度平面圖；e-溫度與IPTG濃度交互圖；f-溫度與IPTG濃度平面圖圖7 各因素交互作用對產酶水平影響的響應面Fig.7 Response surface analysis for interactive effects of pH,induced temperature and IPTG concentration on enzymic production level of recombinant E. coli

表7 不同培養基中菌體生長與產酶水平Table 7 Bacterial growth and enzyme production in different media

3 結論

經過優化培養基各組分后，確定重組大腸桿菌產乙酰乳酸合成酶的最適發酵培養基組分為：葡萄糖12 g/L，蛋白胨10 g/L，檸檬酸鈉0.25 g/L，KH2PO40.05，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，NaCl 0.1 g/L；最佳條件為pH=7.0，誘導溫度30.2 ℃，IPTG濃度0.42 mmol/L，誘導時間10 h。在此條件下進行搖瓶發酵，單位菌體產酶量(164.299 kU/g)和產酶水平(266.657 U/mL)分別是LB培養基的1.31和 1.77倍。本實驗為提高具有活性的乙酰乳酸合成酶產量，及增強雙乙酰的合成代謝流及低成本大量生產酶制劑增補一些數據和資料基礎。