發(fā)酵米粉中優(yōu)良細(xì)菌的分離篩選及鑒定

熊香元，張立釗，陳力力*，龔慧可，周玥，任佑華

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙, 410128)2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))，湖南 長(zhǎng)沙, 410128)

發(fā)酵米粉是我國(guó)南方一種傳統(tǒng)食品，目前發(fā)酵米粉多采用自然發(fā)酵方式生產(chǎn)，即利用原料和 “續(xù)渣液”中的微生物在自然條件下完成大米浸泡發(fā)酵，再經(jīng)過(guò)磨漿、蒸煮、擠壓成型等工序制成米粉[1]。大米在浸泡發(fā)酵過(guò)程中，由于微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和酶等代謝產(chǎn)物作用使大米化學(xué)成分以及保水力、糊化特性、熱特性、老化特性等大米(粉)淀粉特性發(fā)生改變，從而改善了成品米粉的蒸煮品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)特性、食味品質(zhì)等食用品質(zhì)[2]。

自然發(fā)酵過(guò)程中微生物組成復(fù)雜，其種群易受環(huán)境影響，發(fā)酵時(shí)間隨季節(jié)變化差異較大，使產(chǎn)品工藝參數(shù)、生產(chǎn)過(guò)程難以實(shí)現(xiàn)規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，造成產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[3]。有學(xué)者分離鑒定米粉發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物是乳酸菌和酵母菌[4-5]，近年來(lái)有許多研究認(rèn)為秈米中淀粉結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和脂肪含量影響米粉的峰值黏度、凝膠強(qiáng)度和口感等[6-9]，發(fā)酵過(guò)程中微生物產(chǎn)生的淀粉酶改變大米淀粉中直/支比例，提高米粉糊化和凝膠特性[10]；蛋白酶不僅為微生物提供自身生長(zhǎng)所需的氮源，還減少大米蛋白質(zhì)，使米粉食味品質(zhì)更好[11];脂肪酶將脂肪分解為游離脂肪酸，增加米粉香氣，提升米粉感官品質(zhì)[12]。微生物胞外酶是微生物代謝過(guò)程中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其活性強(qiáng)弱是判斷菌株是否具有制備成發(fā)酵劑的關(guān)鍵[13]。然而，目前以產(chǎn)酸、產(chǎn)酶活力為考核指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵米粉中優(yōu)良菌株篩選的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)以大米發(fā)酵液中菌株的產(chǎn)酸和產(chǎn)酶活力為綜合考核指標(biāo)，進(jìn)行菌株分離篩選,獲得適合米粉發(fā)酵的優(yōu)良菌株，為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵環(huán)節(jié)的合理控制,推進(jìn)發(fā)酵米粉從傳統(tǒng)自然發(fā)酵向標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)型，提高產(chǎn)品質(zhì)量并保證品質(zhì)穩(wěn)定,制備純種發(fā)酵菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為湖南常德鮮濕米粉加工廠發(fā)酵3 d大米浸泡發(fā)酵液；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；珍桂矮1號(hào)秈米，陽(yáng)春市宏興糧食加工廠；試驗(yàn)試劑為Na2CO3、三氯乙酸、NaOH、干酪素、酪氨酸、葡萄糖、淀粉、檸檬酸鈉、檸檬酸、福林酚試劑、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、對(duì)硝基苯酚、異丙醇、Tris-HCl、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司； SPX-250BⅢ恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司； FE28-PH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司; LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；GF-M3000酶標(biāo)儀,山東高密彩虹分析儀器有限公司； TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離純化

采用稀釋平板分離法將樣品按傾注法接種于MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)后挑取菌落形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)移至MRS斜面培養(yǎng)基，進(jìn)行編號(hào)后置于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 菌株的篩選

將試管斜面菌株活化后按1%接種量接種于初始pH為6.66大米液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)培養(yǎng)后用pH計(jì)測(cè)定上清液pH，初篩出產(chǎn)酸能力較強(qiáng)菌株。

將初篩菌株分別采用3,5-二硝基水楊酸比色法[14]、福林酚法[15]、對(duì)硝基苯酚法[16]測(cè)定淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性，進(jìn)行發(fā)酵米粉優(yōu)良菌株的復(fù)篩。淀粉酶活定義為1 mL發(fā)酵液在40 ℃，pH 5.6條件下5 min內(nèi)水解1% 淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)；蛋白酶活定義為在40 ℃, 一定pH值條件下, 1 min內(nèi)催化酪蛋白水解產(chǎn)生1 g酪氨酸所需酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位 (U)；脂肪酶活定義為在 37 ℃、 pH 8.0條件下，以1 μmol/min釋放對(duì)硝基苯酚所需酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.3 形態(tài)特征及生理生化鑒定

分別將篩選得到的優(yōu)良菌株劃線接種在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，適當(dāng)條件培養(yǎng)后，觀察菌落大小、顏色、形態(tài)、質(zhì)地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結(jié)構(gòu)等群體形態(tài)特征；進(jìn)一步革蘭氏染色，顯微鏡下觀察革蘭氏染色顯色反應(yīng)、細(xì)胞形態(tài)和排列方式等菌體形態(tài)特征；并對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]和API試劑盒檢測(cè)進(jìn)行菌屬初步鑒定。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

采用Bacteria Genomic DNA kit 試劑盒進(jìn)行菌株基因組DNA提取，采用16S rDNA通用引物序列27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增達(dá)到純化要求的產(chǎn)物割膠回收，送往杭州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將獲得的序列與NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)和分析，利用MEGA-X 軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 18.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)平行3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

2.1.1 菌株產(chǎn)酸能力

從MRS平板培養(yǎng)基上獲得118株產(chǎn)酸菌株保藏于斜面試管。以pH<4.5為指標(biāo)，篩選出35株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)菌株，如表1所示。由于產(chǎn)酸能力與菌株的生長(zhǎng)能力有關(guān)，生長(zhǎng)速率與所測(cè)發(fā)酵液pH值呈負(fù)相關(guān)，因而測(cè)定菌株發(fā)酵液pH值可反映乳酸菌的發(fā)酵性能。表中發(fā)酵液中pH最小值為4.12，與初始培養(yǎng)基中pH 6.66相比，發(fā)酵液中pH值下降了2.52，pH變化值較大，說(shuō)明初篩出的菌株具有良好的產(chǎn)酸性能。

表1 不同菌株2 d發(fā)酵液pH值Table 1 Different strains in 2 d′s pH value of fermentation broths

2.1.2 菌株產(chǎn)酶活力

35株菌株淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性如圖1、圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力不同，35株菌株中R112淀粉酶、脂肪酶活性最高分別為210.43、2.15 U/mL，R1212蛋白酶活性最高為9.34 U/mL。所有菌株淀粉酶活性在17.57 ～210.43 U/mL，菌株間淀粉酶活性極差為192.86 U/mL，差異性顯著。但35株菌株中只有27株檢測(cè)到了蛋白酶活性，占77.14%，14株檢測(cè)到了脂肪酶活性，只占40%。值得注意的是菌株R1212蛋白酶活性最高為9.34 U/mL，淀粉酶活性也具有較高水平為179.71 U/mL，但未檢測(cè)到脂肪酶活性，這說(shuō)明單一菌株產(chǎn)酶能力各有不同，發(fā)酵米粉優(yōu)良菌株的獲得需要結(jié)合其他分析方法進(jìn)一步篩選。

圖1 不同菌株淀粉酶活性Fig.1 Amylase activity of different strains

圖2 不同菌株蛋白酶、脂肪酶活性Fig.2 Protease and lipase activity of different strains

2.1.3 菌株酶活力主成分分析

根據(jù)各菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性結(jié)果，利用SPSS進(jìn)行主成分分析，并利用Origin繪圖，得到各個(gè)菌株主成分得分圖(圖3)。第1主成分方差累積貢獻(xiàn)率為57.09%，主要反映了淀粉酶活性；第2主成分方差累積貢獻(xiàn)率為22.52%主要反映了蛋白酶和脂肪酶活性。得分較高的菌株編號(hào)分別為R02、R1212、R29,、R1310、R133、R112、R13。這些菌株相較于其他菌株有較強(qiáng)的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性。因此最終篩選出發(fā)酵性能較好的這7株菌株進(jìn)行鑒定，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

圖3 菌株篩選主成分得分圖Fig.3 Score of principal components in strain screening

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

部分典型菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如圖4所示，7個(gè)菌株分為3種類(lèi)型。R13、R1212、R02、R1310、R133五個(gè)菌株菌落呈圓形、乳白色、表面光滑、凸起、邊緣整齊、不透明，革蘭氏染色為G+、球菌，成對(duì)排列或形成四聯(lián)狀，無(wú)芽孢；菌株R29菌落呈圓形、白色，略有光澤，隆起，邊緣整齊，不透明，革蘭氏染色為G+、桿菌；R112菌落呈圓形，灰白色，不透明，邊緣不整齊，表面粗糙，無(wú)光澤，革蘭氏染色為G+、桿菌。

2.2.2 菌株生理生化鑒定

根據(jù)各菌株的群體形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特點(diǎn)，將疑似乳酸菌的菌株R13、R1212、R02、R1310、R133、R29用API50CHL乳酸菌鑒定系統(tǒng)試劑條輔助進(jìn)行生理生化鑒定，檢驗(yàn)菌株對(duì)49種碳源的利用能力，將對(duì)照作為陰性，底物被利用的反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性。在法國(guó)梅里埃公司官網(wǎng)上利用API LAB Plus自動(dòng)判讀系統(tǒng)對(duì)試紙條判定結(jié)果進(jìn)行鑒定(表2)。菌株R13、R1212、R02、R1310、R133鑒定為戊糖片球菌，R29鑒定為發(fā)酵乳桿菌。將疑似芽孢桿菌菌株R112參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中有關(guān)芽孢桿菌的主要生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表3所示。根據(jù)芽孢桿菌的主要生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步判定R112為枯草芽孢桿菌。

A～C-R133、R29和R112菌落形態(tài)；D～F-R133、R29和R112顯微鏡檢圖圖4 典型菌落形態(tài)及顯微鏡鏡檢圖(×100)Fig.4 Typical colony morphology and microscopic examination

表2 乳酸菌生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 6 strains

表3 菌株R112生理生化鑒定Table 3 Physiological of biochemical characteristics of Bacillus

2.2.3 16S rDNA基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

7菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為1 000～2 000 bp，條帶清晰明亮(圖5)，其序列測(cè)定結(jié)果提交GenBank，與已知序列進(jìn)行比對(duì)，并利用軟件MEGA.X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)樹(shù)的構(gòu)建(圖6)。結(jié)果表明，菌株R29與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)位于同一分支,自展值為100%；菌株R133、R02、R1212、R1310、R13與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)位于同一分支，自展值為65%；菌株編號(hào)R112與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)位于同一分支，自展值為63%。各分支自展值均高于50%，根據(jù)16S rDNA鑒定結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化結(jié)果得到各個(gè)菌株分子鑒定結(jié)果如表4所示，菌株R29為發(fā)酵乳桿菌，R133、R02、R1212、R1310、R13為戊糖片球菌，菌株R112為芽孢桿菌屬，并根據(jù)生化試驗(yàn)可以判定為屬于芽孢桿菌屬中第一群中的枯草芽孢桿菌。

表4 菌株同源性分析結(jié)果Table.4 Homological analysis of strains

圖5 七菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.5 Seven strains′ gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products

3 討論

米粉發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌利用大米中碳水化合物產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸，促進(jìn)大米中部分蛋白質(zhì)溶出，使大米淀粉得到純化，提高米粉的力學(xué)性質(zhì)和食用品質(zhì)；同時(shí)有機(jī)酸顯著降低大米發(fā)酵液pH，抑制其他雜菌生長(zhǎng)，提高米粉生產(chǎn)安全性。然而，閔偉紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵米粉的品質(zhì)較乳酸大米處理后制成的米粉品質(zhì)改善更顯著，這說(shuō)明發(fā)酵米粉品質(zhì)改善不僅是有機(jī)酸起作用，可能還與微生物生長(zhǎng)代謝的其他產(chǎn)物及其分泌的胞外酶所催化的生化反應(yīng)等有關(guān)。為此，本研究將從樣品中分離得到的118株菌株以產(chǎn)酸能力為首選指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵米粉優(yōu)良菌株篩選后獲得35株產(chǎn)酸能力良好的菌株，隨后在考核菌株產(chǎn)酸能力的基礎(chǔ)上以淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力為指標(biāo)進(jìn)行菌株復(fù)篩，并通過(guò)主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，獲得了7株優(yōu)良菌株，經(jīng)鑒定為戊糖片球菌、發(fā)酵乳桿菌、枯草芽孢桿菌3類(lèi)。

a-乳桿菌16SrDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);b-片球菌16SrDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);c-芽孢桿菌16SrDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖6 七株菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of 7 isolated strains based on 16S rDNA sequence

枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)內(nèi)生孢子的一群芽孢菌。枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)十分豐富，其產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶在食品工業(yè)得到廣泛應(yīng)用[20-21]，另有研究表明枯草芽孢桿菌通過(guò)三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝能產(chǎn)生乳酸、丙酮酸等有機(jī)酸[22]，已經(jīng)應(yīng)用于飼料、食品發(fā)酵等多個(gè)領(lǐng)域[23]；戊糖片球菌因其益生功能已在發(fā)酵蔬菜、乳制品、肉制品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[24], 發(fā)酵乳桿菌和枯草芽孢桿菌已有應(yīng)用于大米發(fā)酵中的相關(guān)報(bào)道[25]，與本研究篩選出的優(yōu)良菌株一致，但是鮮見(jiàn)開(kāi)展相關(guān)酶活性的研究。本研究篩選出的枯草芽孢桿菌R112產(chǎn)酶活力較強(qiáng)，蛋白酶活性為8.35 U/mL，高于李蕓[26]篩選出的枯草芽孢桿菌蛋白酶活力(3.15 U/mL)，且具有良好的產(chǎn)酸能力和芽孢桿菌抗逆性能抵抗不良外界因素；乳酸菌同時(shí)具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶多種酶活力，在米粉專(zhuān)用發(fā)酵劑研發(fā)中有重要價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究從大米發(fā)酵液樣品中分離獲得7株具有良好產(chǎn)酸能力以及淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的菌株。通過(guò)生理生化試驗(yàn)和16S r DNA分子鑒定得出R133、R02、R1310、R1212、R13共5個(gè)菌株為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，R29為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，R112為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。R02、R29等均可以作為米粉專(zhuān)用發(fā)酵劑開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)菌株，但是為了適應(yīng)于工廠化米粉發(fā)酵生產(chǎn)，需要進(jìn)一步采用育種技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良研究。