鳥嘌呤核苷酸抑制因子2基因表達與肝癌細胞遷移和侵襲能力的關系*

王雅冰 趙孟杰 孫景武 石林昌

河北中石油中心醫院肝膽外科 (河北 廊坊，065000)

目前臨床上治療肝癌的有效方法主要是手術及肝移植，但即使手術成功，患者仍需要長時間恢復[1]。鳥嘌呤核苷酸抑制因子2(RhoGDI2)是小G蛋白調節因子家族成員之一[2]，是一種腫瘤轉移相關因子[3]。有研究報道RhoGDI2在胃癌、肺癌及乳腺癌細胞中的表達水平并不一致，但關于RhoGDI2在肝癌組織中的表達情況及其作用并無相關報道。本文在相關文獻報道的基礎上[4]，進一步研究RhoGDI2基因在肝癌細胞中表達水平是否受miRNAs的調控；通過一系列實驗下調RhoGDI2表達，研究相關表達對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 選取高轉移潛能肝癌細胞株HCCLM3細胞，隨機分為對照組、空白轉染組、shRNA轉染組，其中空白轉染組轉染空白質粒，shRNA轉染組轉染RhoGDI2-shRNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及轉染 肝癌細胞培養：肝癌HCCLM3細胞在含10%胎牛血清DMEM完全培養基、5% CO2飽和濕度、37℃培養箱內常規傳代培養。腺病毒感染：按每細胞5病毒感染，HCCLM3細胞鋪6孔板，待底面積上細胞長至80%時，用AdNDRG2或AdLacZ處理48 h(病毒感染量為5 MOI)。siRNA轉染：HCCLM3細胞鋪6孔板，待底面積上細胞長至80%時，運用脂質體法轉染siRNA-NDRG2或siRNA-NC作用細胞48 h。

1.2.2 細胞侵襲、遷移試驗 將腺病毒或siRNA作用48 h后的肝癌細胞種于使用Matrigel膠預處理的24孔Transwell上層小室，加入無血清培養液500 μl，加含10%胎牛血清的培養液于下層小室中。24 h后將培養液倒出，乙醇固定Transwell 15 min后龍膽紫染色10 min,最后用棉簽去除上層小室底壁上的細胞，光鏡下計數通過Matrigel膠侵襲到下層中的細胞數。重復以上實驗3次。

1.2.3 Western Blot檢測[5]將對照組和處理組的HCCLM3細胞用預冷的無菌PBS緩沖液清洗2遍，加細胞裂解液。用干凈的細胞刮刀將貼壁細胞刮下，吹打，混勻，收集細胞裂解液于1.5 ml離心管中。95℃孵育5 min，立即在冰上冷卻。超聲8 s，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清蛋白提取液，-80℃保存并做好記錄。采用BCA法進行蛋白定量測定，參照 BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行[6]。

1.2.4 qRT-PCR檢測[7]提取細胞總RNA并將其反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行qPCR 。qPCR擴增體系設置為20 μl體系，cDNA模板不稀釋，內參基因為GAPDH。觀察擴增曲線及熔解曲線。從擴增曲線可以看出，4個復孔的熒光值曲線擬合良好，CT值接近，說明反應體系穩定，可重復性好，結果可靠。從熔解曲線可以看出，曲線為一個主峰，曲線頂峰溫度穩定，說明擴增產物具有特異性。計算 2-△△CT，并進行統計學分析。

2 結果

2.1 各組細胞RhoGDI2 mRNA表達情況 shRNA轉染組細胞RhoGDI2 mRNA相對表達量為(0.201±0.082)，明顯低于對照組(0.760±0.130)和空白轉染組(0.763±0.121)，差異有統計學意義(F=21.011，P<0.05)。

2.2 各組細胞增殖情況 shRNA轉染組細胞培養6 h、12 h和24 h時OD值明顯低于對照組和空白轉染組(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞不同時間點OD值比較

2.3 各組細胞遷移能力比較 shRNA轉染組細胞遷移率為(0.310±0.030)%，明顯低于對照組(0.708±0.041)%和空白轉染組(0.710±0.031)%,差異有統計學意義(F=9.182，P<0.05)。見彩插頁圖1。

2.4 各組細胞侵襲能力比較 shRNA轉染組細胞穿膜細胞數為(9.28±1.11)個，明顯低于對照組(42.01±13.10)個和空白轉染組(44.92±12.90)個，差異有統計學意義(F=21.192，P<0.05)。見彩插頁圖2。

2.5 各組細胞MMP-9、pAKT和VEGF表達 shRNA轉染組細胞MMP-9、pAKT和VEGF相對表達量明顯低于對照組和空白轉染組(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組細胞MMP-9、pAKT和VEGF表達比較

A：對照組 B：空白轉染組 C：shRNA轉染組

3 討論

肝癌的致病因素各種各樣，發病機制不明[8]，也缺乏判斷其發病原因的有效指標。肝癌的早期診斷對肝癌治療具有重要作用。隨著腫瘤基因組學的發展，人們便對腫瘤的發展及機制有了更全面的認知，也為腫瘤的早期診斷和基因治療提供了理論基礎。已有研究發現，肝癌發生、發展的重要分子學機制是癌基因的異常表達和抑癌基因表達的明顯減少甚至缺失[9]。現階段肝癌的研究主要集中在識別與發現和肝癌發生發展有關的特異性基因，并以此為靶點尋找肝癌的早期診斷方法和有效治療手段。肝癌發生的重要原因主要是正常肝細胞的惡性轉化及凋亡調控功能的異常，因此對凋亡調控失調的相關研究可能找到治療腫瘤的方法[10]。機體內外的多種因素均可能影響甚至改變細胞凋亡進程，對這些因素的干預可以在不同的節點上調控細胞凋亡的進程和數量。RhoGDI2基因在腫瘤的發生、發展和轉歸過程中發揮著重要的作用，已有研究證實了RhoGDI2基因與細胞的生長和分化相關，但在不同癌癥組織中RhoGDI2 的作用并不相同，作用途徑亦各有區別，還與腫瘤細胞的增殖及侵襲有極大的聯系[11]。同時RhoGDI2在缺氧和應激反應中也有著重要作用，是樹突狀細胞抑制T淋巴細胞增殖所必需的共同刺激信號，也是醛固酮對腎遠曲小管和集合管的水鈉代謝調節的重要紐帶[12]。

本研究結果顯示，shRNA轉染組細胞RhoGDI2 mRNA相對表達量、OD值、穿膜細胞數，MMP-9、pAKT和VEGF表達明顯低于對照組和空白轉染組，說明 RhoGDI2基因與肝癌的的發生、增殖及侵襲過程呈正相關，RhoGDI2會影響腫瘤侵襲轉移，因此研究RhoGDI2基因將有助于加深對肝癌侵襲轉移機制的了解，并為肝癌特異性和多靶位的治療方法研究提供理論基礎[13]。本研究在前期研究的基礎上進一步從mRNA水平探索RhoGDI2對肝癌遷移和侵襲能力的影響，提示該基因可能參與了肝細胞肝癌的發生和發展，具有一定的創新性和臨床指導意義。