雙波長HPLC法同時測定逐痰通絡合劑中3種有效成分

錢智 陶紅慧 尤曉燕 濮梁 趙慧

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院黃埔分院,上海 200011)

逐痰通絡合劑是由上海市食品藥品監督管理局批準的上海市黃埔中心醫院的醫療機構制劑。該制劑由牛蒡子、僵蠶、天南星、澤瀉、丹參、甘草、川牛膝、地龍、威靈仙等十一味藥材組成，具有逐痰利水，活血通絡的功效[1]。其中牛蒡子具有豁痰消腫，通十二經絡之功效，《本草綱目》中謂之能散結除風，和要腰膝凝滯之氣，為君藥；丹參、當歸有養血活血化淤的功效，為臣藥；甘草能調和諸藥是屬佐使之用。該制劑為醫療機構制劑，原質量標準中未見含量測定項。根據復方中成藥的特點，為了更有效的控制藥物的質量[2]，本文采用雙波長HPLC法建立了逐痰通絡合劑中牛蒡苷、丹酚酸B和甘草酸這3種有效成分的含量測定方法[3-6]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器(美國安捷倫公司)；Sartorius?A200S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；80-2醫用離心機(江蘇信康醫療器械有限公司)。

1.2試藥 丹酚酸B對照品(批號：111562-201716，純度94.1%，中國食品藥品檢定研究院)；牛蒡苷對照品(批號：5740，純度97.5%，上海詩丹德標準技術服務有限公司)；甘草酸銨對照品(批號：5733，純度94.2%，上海詩丹德標準技術服務有限公司)。逐痰通絡合劑(批號：170620、170807、170906、170920、171024、171128、180109、180206、180418、180530)。相應的陰性空白樣品處方1(不含丹參)、處方2(不含甘草)和處方3(不含牛蒡子)(由黃浦區中心醫院按處方配制)。乙腈(斯百泉化學有限公司)，水為娃哈哈純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件及系統適應性 色譜柱 ：Waters Atlantis dC18，μm,4.6 mm×150 mm；流動相：A 水(0.1%乙酸)-B 乙腈(0.1%乙酸)； 梯度洗脫(0～20 min，20%B～25%B；20～40 min，25%B～45%B；40～40.1 min，45%B～95%B；40.1～45.0 min，95%B；45.0～45.1 min，95%B～20%B；45.1～50 min，20%B)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為 252 nm(測定甘草酸)和280 nm(測定丹酚酸B和牛蒡苷)；柱溫室溫；進樣5 μL。

2.2對照品溶液的制備 稱取丹酚酸B對照品5.0 mg、牛蒡苷對照品8.0 mg及甘草酸銨對照品4.0 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含丹酚酸B 0.50 mg，牛蒡苷0.80 mg，甘草酸銨(甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.0207)。

2.3供試品溶液的制備 取供試品適量，離心(4000 r/min)約10 min，取上清液用0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4陰性樣品的制備 取處方1、2、3，按照2.3項下處理，分別得到缺丹參、缺牛蒡子和缺甘草的陰性樣品。

2.5方法學考察

2.5.1專屬性考察 將空白、相應對照品、陰性樣品及供試品溶液注入高效液相色譜儀，結果在與對照品色譜峰對應的位置上無相應的峰出現，丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨相應的分離度均>2.0，表明該方法專屬性良好。見圖1。

注：A.空白；B-丹酚酸B對照品；C.牛蒡苷對照品；D.甘草酸銨對照品；E.處方1(缺丹參)；F.處方3(缺牛蒡子)；G.處方2-(缺甘草)；H.樣品180418；I.混合對照品圖1 高效液相色譜圖

2.5.2線性考察 精密稱取丹酚酸B對照品5.0 mg、牛蒡苷對照品8.0 mg及甘草酸銨對照品4.0 mg于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，將其作為母液。用甲醇稀釋母液，得到系列混和對照品溶液，分別進樣，測定峰面積。以進樣質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，回歸方程見表1。

表1 各成分回歸方程與線性范圍

2.5.3檢出限與定量限考察 檢出限：取丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨對照品適量，加甲醇稀釋成濃度分別為1.01 μg/mL、1.0 μg/mL和0.50μg/mL的對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，得到的圖譜中顯示信噪比S/N約為3，即該方法中丹酚酸B檢出限為1.01 μg/mL，牛蒡苷檢出限為1.0 μg/mL，甘草酸銨檢出限為0.50 μg/mL。定量限：以檢測限濃度/3×10來計算，即該方法中丹酚酸B定量限為3.37 μg/mL，牛蒡苷檢出限為3.33 μg/mL，甘草酸銨檢出限為1.67 μg/mL。

2.5.4精密度考察 重復性考察：取選定樣品180418按本測試方法中樣品配制方法重復配制六個樣品溶液進行測試，將6次檢測結果計算相對偏差%RSD以驗證方法精密度。結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.9%、0.8%和1.1%。中間精密度考察：在不同時間，使用同一品牌的其他色譜柱進行樣品180418含量測定，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨含量的百分誤差分別為3.6%、2.5%和0.3%。

2.5.5穩定性考察 精密吸取同一對照品溶液分別在0、3、6、9、13、14小時內進樣，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.2%、0.5%和1.1%。

2.5.6準確度考察 取陰性樣品按2.4法進行處理，分別1:1加入相對應的丹酚酸B對照品(1.01 mg/mL)、牛蒡苷對照品(1.0 mg/mL)和甘草酸銨對照品(1.0 mg/mL)，用0.45 μm濾膜濾過，進樣測定回收率。結果顯示丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰的回收率分別為94.1%、98.2%和102.1%，RSD分別為2.4%、4.3%和2.0%。

2.5.7耐用性考察 將樣品180418分別在0，48 h進行含量測定，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.7%、0.4%和0.5%。將樣品180418分別在柱溫30℃和20℃(室溫)進行含量測定，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為1.0%、0.1%和2.3%。將樣品180418分別在流速0.9 mL/min和1.0 mL/min進行含量測定，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.6%、0.4%和1.0%。將樣品180418分別用同一品牌的不同色譜柱進行含量測定，結果丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨峰面積的百分誤差分別為0.3%、1.5%和0.0%。

2.6十批樣品含量測定 取逐痰通絡合劑(批號：170620、170807、170906、170920、171024、171128、180109、180206、180418、180530)，分別進行含量測定，結果見表2。

表2 10批逐痰通絡合劑含量測定結果(mg/mL)

3 討 論

實驗考察了采用水、甲醇、乙腈、無水乙醇進行稀釋過濾處理，以及不同離心轉速、不同離心時間等方法。結果表明，在指定的色譜分析條件下，供試品溶液的制備方法是比較好且方便快捷的。采用DAD檢測器對丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨進行了全波長掃描，根據其其最大吸收波長及吸收曲線，選擇252 nm檢測波長測定甘草酸銨含量，選擇280 nm檢測波長同時測定丹酚酸B和牛蒡苷含量。實驗比較了乙腈-水、乙腈-水(0.1%甲酸)、乙腈-水(0.1%乙酸)、乙腈(0.2%乙酸)-水(0.2%乙酸)和乙腈(0.1%乙酸)-水(0.1%乙酸)流動相體系下的梯度分離情況以及不同品牌的反相C18色譜柱的分離情況，結果顯示，指定的色譜分析條件分離效果較好。

本文所建立的雙波長HPLC法同時測定逐痰通絡合劑中的丹酚酸B、牛蒡苷和甘草酸銨的方法，該方法具有操作簡便快捷，準確可靠，靈敏度高，能夠作為逐痰通絡合劑以及類方的質量評價與控制。